БИОЛОГИЯ ВНУТРЕННИХ ВОД, 2013, № 4, с. 82-88
УДК 597.554.3:574.64+595.3:574.64
ВЛИЯНИЕ ГЕРБИЦИДА РАУНДАП НА АКТИВНОСТЬ ГЛИКОЗИДАЗ В ОРГАНИЗМЕ БЕСПОЗВОНОЧНЫХ ЖИВОТНЫХ И МОЛОДИ РЫБ
© 2013 г. А. И. Аминов, И. Л. Голованова, А. А. Филиппов
Институт биологии внутренних вод им. И.Д. Папанина РАН, 152742 пос. Борок, Ярославская обл., Некоузский р-н, e-mail: golovan@ibiw.yaroslavl.ru Поступила в редакцию 26.01.2012 г.
Исследованы активность мальтазы, сахаразы, а также амилолитическая активность в целом организме беспозвоночных и молоди рыб при действии in vitro гербицида Раундап в концентрации 0.1— 50 мкг/л. Гликозидазы у беспозвоночных менее чувствительны к действию гербицида, чем у молоди рыб. Раундап оказывает больший ингибирующий эффект на активность гликозидаз в тканях реальной жертвы (плотвы, извлеченной из желудка щуки) по сравнению с потенциальной жертвой (плотвой из водоема). Величина и направленность эффектов зависят от вида животных и концентрации токсиканта.
Ключевые слова: гербицид, Раундап, рыбы, беспозвоночные, пищеварительные ферменты, гликози-дазы.
DOI: 10.7868/S0320965213040037
ВВЕДЕНИЕ
Раундап — один из самых известных гербицидов, созданных на основе изопропиламиновой соли глифосата [N-(phosphonomethyl) glycine]. Он широко используется для уничтожения сорной растительности на полях, в коллекторно-дренаж-ных каналах, оросительных системах и прудах. Период полураспада глифосата в почве от 30 до 90 сут, в воде 7—14 сут [17], в его разрушении принимает участие микробиота [23]. Благодаря высокой способности абсорбироваться на взвешенных частицах он может разноситься по течению на большие расстояния, оседая в донных отложениях, где долго сохраняет свою активность. Механизм действия Раундапа заключается в ингибировании ферментного пути с участием шихимовой кислоты, что препятствует синтезу трех ароматических аминокислот: фенилаланина, тирозина и триптофана [12, 23]. Попадая в организм гидробионтов, гербицид включается в метаболизм и вызывает нарушения различных функций организма [12, 22, 25]. Значения 96-ч ЛК50 Раундапа варьируют от 2 до 55 мг/л в зависимости от вида рыб, стадии жизненного цикла и условий эксперимента [22], в то время как значение 96-ч ЛК50 глифосата (активный ингредиент Раундапа) для карпа Cyprinus carpio (L.) значительно выше — 620 мг/л [25].
В последние годы накоплено большое количество данных о токсичности Раундапа для водных организмов, в том числе беспозвоночных и рыб [2, 6, 9, 12, 13, 16, 27, 31, 33]. Водные животные, в
частности рыбы, могут быть более чувствительны к Раундапу, чем млекопитающие [20]. Несмотря на то что основной токсический эффект Раундапа связывают с действием глифосата, в ряде работ [17, 23, 26] установлено, что входящее в состав гербицида поверхностно-активное вещество — поли-оксиэтиленамин, может быть гораздо более токсично, чем активный ингредиент. Результаты тестов с Hydra attenuate Pallas показали, что токсичность Раундапа зависит от соотношения активного и вспомогательного компонентов, а также от концентрации гербицида [14].
Действие Раундапа на активность ферментов, которые гидролизуют углеводы в тканях животных, входящих в состав кормовой базы рыб различных экологических групп, изучено крайне слабо [5, 10]. Поскольку углеводы играют важную роль в энергетическом и пластическом обмене организма, а гидролазы жертвы могут принимать участие в пищеварении и обеспечивать аутодегра-дацию собственных тканей [8], изучение характеристик указанных ферментов при действии Раун-дапа представляет значительный интерес не только для экологической физиологии, но и для практики рыбного хозяйства.
Цель работы — изучить влияние in vitro гербицида Раундап в сублетальных концентрациях (0.1—50.0 мкг/л) на активность гликозидаз в целом организме беспозвоночных животных и молоди рыб.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объекты исследования — молодь восьми видов пресноводных костистых рыб: судака Stizostedion lucioperca (L.) (масса тела 0.23 ± 0.01 г, длина тела 2.64 ± 0.06 см), щуки Esox lucius L. (9.64 ± 0.92 г, 11.20 ± 0.31 см), плотвы Rutilus rutilus (L.) (0.25 ± ± 0.01 г, 3.12 ± 0.05 см), речного окуня Percafluviati-lis L. (0.63 ± 0.05 г, 4.02 ± 0.09 см), тюльки Clupeonel-la cultriventris (Nord.) (0.55 ± 0.03 г, 3.72 ± 0.4 см), карпа Cyprinus carpio (L). (1.33 ± 0.15 г, 4.03 ± 0.14 см), карася серебряного Carassius auratus (L.) (2.11 ± 0.50 г, 3.93 ± 0.27 см), ротана Perccottusglenii Dyb. (0.82 ± ± 0.11 г, 3.59 ± 0.10 см), а также беспозвоночные животные: рачковый зоопланктон (суммарные пробы, включающие представителей отр. Dafnii-formes, Copepoda и Ostracoda), личинки хироно-мид Chironomus plumosus (L.) и моллюски: дрейс-сена Dreissena polymorpha (Pall.) и прудовик большой Limnea stagnalis (L.) Рыб и беспозвоночных животных отлавливали в прибрежной зоне Рыбинского водохранилища в летний период и в течение 1-2 ч доставляли в лабораторию.
Активность гликозидаз определяли в гомоге-натах целого организма беспозвоночных и рыб. Животных помещали на стекло ледяной бани и наиболее крупных измельчали ножницами (у моллюсков предварительно удаляли раковину). С помощью стеклянного гомогенизатора готовили суммарные пробы, включающие несколько сотен рачков либо 10—20 экз. моллюсков или молоди рыб, добавляя охлажденный до 2—4°C раствор Рингера для холоднокровных животных (110 ммоль NaCl, 1.9 ммоль KCl, 1.3 ммоль CaCl2, pH 7.4) в соотношении 1:9. Затем исходный гомо-генат дополнительно разводили раствором Рин-гера в 2—10 раз. Растворы субстратов (растворимого крахмала (18 г/л), сахарозы (50 ммоль/л) и мальтозы (50 ммоль/л)) готовили на таком же растворе Рингера. Гомогенаты и растворы субстратов инкубировали в течение 30—60 мин при температуре 20°C, рН 7.4 и непрерывном перемешивании.
Для определения активности мальтазы KФ 3.2.1.20 применяли набор для клинической биохимии "Фотоглюкоза" (ООО "Импакт", Россия). Активность сахаразы KФ 3.2.1.48, а также амилолитическую активность (отражающую суммарную активность ферментов, гидролизующих крахмал, — a-амилазы KФ 3.2.1.1, глюкоамилазы KФ 3.2.1.3 и мальтазы), оценивали по приросту гексоз модифицированным методом Нельсона [11]. Ферментативную активность в каждой точке определяли в пяти повторностях с учетом фона (содержание глюкозы в исходном гомогенате) и выражали в микромолях продуктов реакции, образующихся за 1 мин инкубации ферментативно-активного препарата и субстрата в расчете на 1 г влажной массы ткани (мкмоль/(г • мин)).
Для приготовления растворов токсиканта использовали коммерческий препарат гербицида, имеющий торговое название "Раундап" (произведен и расфасован ЗАО фирмы "Август" (Россия) по лицензии фирмы "Монсанто Европа С. А." (Бельгия)). Средство представляет собой 36%-ный водный раствор глифосата. Возможные инертные ингредиенты, усиливающие действие активного элемента или облегчающие использование гербицида, в аннотации не указаны. Выбор тестируемых концентраций обусловлен установленными значениями ПДК для воды рыбохозяйственных водоемов (0.001 мг/л), а также значениями 96-ч ЛК50 Раундапа для рыб и дафний (от 2 до 168 мг/л) [10, 28]. Гомогенаты предварительно инкубировали в присутствии Раундапа (в контроль вместо токсиканта добавляли равное количество раствора Рингера) в течение 1 ч. Концентрации Раунда-па, рассчитанные по содержанию глифосата, составляли 0.1, 1, 10, 25 и 50 мкг/л.
Полученные данные обработаны статистически с помощью пакета прикладных программ Statgraphics Plus 5.1 и Excel 2003. Результаты представлены в виде средних и их ошибок (M± m). Достоверность различий оценивали с помощью однофакторного анализа (ANOVA, LSD-тест) при p = 0.05 [29].
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В целом организме беспозвоночных при действии Раундапа отмечены разнонаправленные изменения амилолитической активности: максимальное повышение на 21% выявлено у прудовика, максимальное снижение на 30% контроля — в тканях рачкового зоопланктона (табл. 1). У хиро-номид ферментативная активность снижается в меньшей степени (на 7—12% контроля). У дрейс-сены низкие концентрации Раундапа (0.1 и 1 мкг/л) снижают амилолитическую активность на 12 и 14% соответственно, в то время как более высокие (25—50 мкг/л) — увеличивают на 14—20% контроля. Активность мальтазы в присутствии Раундапа достоверно повышается на 6—27%, сахаразы — на 7—53% контроля у всех исследованных беспозвоночных животных.
В целом организме молоди рыб в присутствии Раундапа отмечены разнонаправленные эффекты. У щуки и плотвы амилолитическая активность повышается на 19-46% контроля при концентрациях Раундапа 10—50 мкг/л (табл. 2). У карпа низкие концентрации токсиканта 0.1 и 1 мкг/л снижают амилолитическую активность на 39 и 17% соответственно, концентрация 25 мкг/л — увеличивает на 15% контроля. У карася и ротана показано снижение амилолитической активности на 11—20% контроля при самой низкой концентрации Раундапа. У других исследованных видов достоверных эффектов не установ-
84 АМИНОВ и др.
Таблица 1. Активность гликозидаз (мкмоль/(г • мин)) в целом организме беспозвоночных при действии in vitro гербицида Раундап
Объект Концентрация Раундапа, мкг/л
0 0.1 1 10 25 50
Амилолитическая активность
Зоопланктон 1.31 ± 0.05a,® 1.10 ± 0.16^ 1.33 ± 0.16a,0 1.60 ± 0.13б 0.92 ± 0.04в 0.86 ± 0.08в
Хирономиды 5.97 ± 0.07a 5.87 ± 0.08a 5.76 ± 0.11a,5 5.55 ± 0.05б,в 5.55 ± 0.10б,в 5.44 ± 0.07в
Дрейссена 2.93 ± 0.06a 2.59 ± 0.06б 2.52 ± 0.05б 3.11 ± 0.07^г 3.52 ± 0.12в 3.33 ± 0.07в,г
Прудовик 7.92 ± 0.30a 7.44 ± 0.21a 7.60 ± 0.13^ 8.32 ± 0.20б 9.12 ± 0.23в 9.60 ± 0.28в
Активность мальтазы
Зоопланктон 1.24 ± 0.01a 1.43 ± 0.02б 1.21 ± 0.07a 1.46 ± 0.07б 1.46 ± 0.06б 1.58 ± 0.11б
Хирономиды 4.94 ± 0.04a 5.26 ± 0.07б 5.31 ± 0.10б,в 5.42 ± 0.07б,в 5.31 ± 0.04б,в 5.55 ± 0.17в
Дрейссена 2.25 ± 0.13a 2.64 ± 0.13a,0 2.31 ± 0.23a,® 2.62 ± 0.14a,® 2.66 ± 0.07б 2.51 ± 0.03a,0
Прудовик 3.15 ± 0.02a 3.24 ± 0.03a 3.21 ± 0.05a 3.49 ± 0.02б 3.31 ± 0.07a,® 3.53 ± 0.14в
Активность сахаразы
Зоопланктон 0.64 ± 0.03a,5 0.80 ± 0.05б,в 0.75 ± 0.13^ 0.97 ± 0.03в 0.58 ±
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.