ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2015, том 464, № 6, с. 753-757
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, ^^^^^^^^^^^^ МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 57.033, 577.1
ВЛИЯНИЕ ГЛАЗНЫХ КАПЕЛЬ SkQ1 НА МЕТАБОЛОМНЫЙ СОСТАВ КРЫСИНОГО ХРУСТАЛИКА И НА ШАПЕРОННУЮ АКТИВНОСТЬ АЛЬФА-КРИСТАЛЛИНА
© 2015 г. Л. В. Яньшоле, В. В. Яньшоле, O. A. Снытникова, А. Ж. Фурсова, Н. Г. Колосова,
Ю. П. Центалович, академик РАН Р. З. Сагдеев
Поступило 08.07.2015 г.
Лечение быстро стареющих крыс линии ОХУ$ глазными каплями привело к задержке развития катаракты и значительному улучшению состояния хрусталика. Сравнение шаперонной активности а-кристаллинов, выделенных из крысиных хрусталиков, не выявило существенной разницы между крысами, получавшими и контрольными животными. Различия в содержании основ-
ных метаболитов (23 соединения) в хрусталиках крыс, получавших и контрольных крыс также
были недостоверны.
Б01: 10.7868/8086956521530026Х
Возрастная ядерная катаракта, которой подвержен большой процент пожилого населения, связана с деградацией долгоживущих макромолекул в хрусталике. Белки составляют примерно 40% от общего веса хрусталика. Их высокая концентрация и упорядоченное распределение в клетках хрусталика обеспечивают высокий показатель преломления и прозрачность хрусталика. Основные белки хрусталика — кристаллины — состоят из трех семейств белков: а-, в- и у-кристал-лины. Было показано [1], что а-кристаллины обладают шаперонными свойствами, что позволяет им предотвращать осаждение денатурированных белков и поддерживать прозрачность хрусталика. Кристаллины хрусталика почти не обновляются и в течение всей жизни индивидуума накапливают посттрансляционные модификации. В конечном итоге эти модификации приводят к окраске, агрегации и нерастворимости кристаллинов, а также к потере шаперонной активности а-кристалли-нов, в результате чего хрусталик мутнеет. Основной причиной развития катаракты является окислительный стресс [2], который приводит к возникновению многочисленных окислительных
Международный томографический центр Сибирского отделения Российской Академии наук, Новосибирск Е-таП: yura@tomo.nsc.ru
Новосибирский государственный университет Государственная Новосибирская областная клиническая больница
Институт цитологии и генетики
Сибирского отделения Российской Академии наук,
Новосибирск
повреждений белков хрусталика. Считается, что антиоксидантные добавки могут замедлить старение глаза и, возможно, обеспечить некоторую защиту против катаракты [3]. Тем не менее попытки предотвратить или замедлить прогресс возрастной катаракты с использованием природных антиоксидантов до сих пор не имели большого успеха [4]. Таким образом, многообещающим является поиск синтетических антиоксидантов, способных уменьшить окислительный стресс внутри хрусталика и предотвратить развитие катаракты.
С этой целью для профилактики возрастных заболеваний глаз недавно был предложен связывающийся с митохондриями антиоксидант 10-(6'-пластохинонил)децилтрифенилфосфоний (8кр1) [5]. На экспериментальных моделях было показано, что прием этого соединения в наномо-лярных концентрациях может предотвратить развитие катаракты [5—7] и других глазных заболеваний, включая возрастную макулярную дегенерацию [5, 8]. В настоящее время проводятся клинические испытания противокатарактально-го эффекта этого препарата, однако механизм его действия не вполне ясен, и влияние его использования на молекулярном уровне не изучено.
Цель настоящей работы — проверка ранних сообщений [5—7] о терапевтическом эффекте 8кр1, а также выявление вызванных лечением 8кр1 изменений в ткани хрусталика, в том числе изменений в метаболоме хрусталика и в шаперонной активности а-кристаллинов.
Для этого мы использовали хрусталики быстро стареющих крыс линии ОХУ8, полученной в Институте цитологии и генетики СО РАН. Первые
754 ЯНЬШОЛЕ и др.
Контроль SkQj
9 месяцев
12 месяцев
Рис. 1. Распределение глаз в зависимости от степени развития катаракты у контрольных крыс и крыс, получавших препарат до лечения (верхние диаграммы, возраст 9 мес) и через три месяца после лечения (нижние диаграммы, возраст 12 мес).
признаки катаракты у крыс OXYS появляются в возрасте 1.5 мес, а в возрасте от 3 мес большинство животных имеют легкую форму катарактных изменений [9]. Зрелая катаракта обнаруживается более чем у половины 12-месячных крыс OXYS. В настоящем исследовании мы использовали крыс OXYS в возрасте от 9 до 12 мес, в период активной прогрессии клинических признаков катаракты.
Препарат SkQ1 был синтезирован в Институте митоинженерии МГУ им. М.В. Ломоносова. В период с 9 до 12 мес жизни в глаза крыс OXYS экспериментальной группы (n = 15) крыс закапывали капли раствора SkQ1 (250 нМ в 0.9% NaCl) по капле в день, крысы контрольной группы (n = = 15) получали капли 0.9% раствора NaCl. Офтальмологический осмотр проводили дважды: до лечения в возрасте 9 мес и после лечения SkQ1 — 12 мес. Степень развития катаракты определяли согласно протоколу классификации помутнений хрусталика (http://eyephoto.ophth.wisc.edu) при исследовании возрастных заболеваний глаза (Age-Related Eye Disease Study, AREDS): 0 — прозрачный хрусталик, 1 — легкое помутнение ядра или коры хрусталика, 2 — множественные помутнения, 3 — интенсивное помутнение ядра или коры хрусталика. Результаты этой серии опытов представлены на рис. 1. До лечения 24 глаза крыс
в контрольной группе имели первую стадию катаракты и 6 глаз — вторую. В экспериментальной группе патологические изменения в 23 глазах соответствовали первой стадии катаракты, 6 глаз — второй стадии, и 1 глаз был без признаков помутнений. Через три месяца у животных контрольной группы был обнаружен заметный прогресс катаракты: ни один глаз не имел первой стадии катаракты, 20 глаз были на второй стадии, и 10 глаз на третьей стадии. Обследование 12-месячных крыс, получавших капли SkQ1, показало намного лучшее состояние глаз: первая стадия катаракты была обнаружена в 11 глазах, а вторая — в 19 глазах.
Для исследования белков мы использовали хрусталики 12-месячных крыс из обеих групп: 7 хрусталиков крыс, которые получали SkQ1, и 7 хрусталиков контрольных животных. Выделенные из хрусталика водорастворимые белки были разделены на а-, в- и у-кристаллины на гель-фильтрационной колонке Agilent Zorbax GF-450 ("Agilent Technologies", США, 9.4 x 250 мм, 6 мкм). При разделении собирали фракции, соответствующие а- и в-кристаллинам. Степень чистоты полученных фракций проверяли хроматографически с одновременным оптическим и масс-спектромет-рическим детектированием. Было установлено, что чистота фракций составляет более 96%, при
Поглощение при 360 нм
Время, с
Рис. 2. Кинетические зависимости агрегации в-кри-сталлинов (0.25 мг/мл) при температуре 70°С в отсутствие а-кристаллинов (1, ■) и в присутствии а-кристаллинов (0.06 мг/мл) из хрусталиков контрольных крыс ОХУ8 (2, А) и крыс ОХУ8, получавших 8к01 (3, О).
этом основными примесями являются другие кри-сталлины. в-кристаллины, выделенные из всех хрусталиков, объединяли и хранили при —70°С до начала эксперимента, а-кристаллины из разных хрусталиков хранили индивидуально.
Оценку шаперонной активности а-кристаллинов проводили на основе подавления тепловой агрегации ß-кристаллинов. Кинетическую зависимость агрегации ß-кристаллинов при концентрации 0.25 мг/мл исследовали при температуре 70°C, детектирование образования агрегатов — при длине волны 360 нм через каждые 30 с после начала эксперимента.
На рис. 2 представлены характерные кинетические кривые агрегации ß-кристаллинов при 70° С в отсутствие и в присутствии а-кристаллинов, полученных из хрусталиков 12-месячных контрольных крыс и крыс, получавших глазные капли SkQ1. Очевидно, что а-кристаллины из обоих типов хрусталиков способны предотвращать агрегацию ß-кристаллинов; однако никаких существенных различий между а-кристаллинами из хрусталиков контрольных крыс и крыс, получавших SkQ1, не было обнаружено.
Мы выбрали время полуагрегации ß-кристаллинов (когда рассеяние света достигает 50% от своего максимального значения) в качестве количественной меры шаперонной активности а-кристаллина. Измерения проводили для 5 образцов ß-кристаллинов (0.25 мг/мл) без а-кристаллинов, 7 образцов ß-кристаллинов с 0.06 мг/мл а-кристаллинов, взятых из разных хрусталиков крыс контрольной группы, и 7 образцов ß-кри-
^TSkQl/CTконтроль
Рис. 3. Отношение концентраций метаболитов в хрусталиках 12-месячных крыс, получавших SkQ1, к концентрациям метаболитов в хрусталиках крыс контрольной группы. X ± ББ, п = 7 для каждой группы.
756
ЯНЬШОЛЕ и др.
сталлинов с 0.06 мг/мл а-кристаллинов, взятых из хрусталиков крыс, получавших 8кр1. Значения времени агрегации Таё для разных типов образцов были усреднены. Полученные результаты показывают, что, действительно, значения шапе-ронной активности а-кристаллинов, выделенных из хрусталиков крыс, получавших и не получавших 8кр1, очень близки:
Та§ (без а-кристаллинов) = (2.9 ± 0.2) • 102 с,
Т^ (а-кристаллин, контроль) = (7.5 ± 1.7) • 102 с,
Та§ (а-кристаллин, 8кд1) = (7.1 ± 1.3) • 102 с.
Метаболомный состав хрусталиков крыс определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием, как было описано ранее [10]. Количественное определение метаболитов проводили для 7 хрусталиков контрольных крыс и для 7 хрусталиков крыс, получавших препарат 8кр1 в каплях. Результаты представляли в виде X ± ББ.
Сравнительный анализ метаболомного состава хрусталиков 12-месячных крыс контрольной и опытной групп (по 7 животных в каждой группе) проводили, используя определение 23 основных метаболитов, включая аминокислоты и антиок-сиданты, содержащиеся в хрусталике. Результаты данной серии экспериментов представлены на рис. 3. Полученные результаты свидетельствуют о том, что лечение 8кр1 не приводит к достоверным изменениям в содержании основных метаболитов в хрусталике.
Результаты, полученные в нашей работе, подтверждают установленную ранее [5—7] способность 8кр1 замедлять ход катарактогенеза. Средняя стадия катаракты в контрольной группе увеличилась с 1.2 в возрасте 9 мес. до 2.3 в возрасте 12 мес.
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.