РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2014, том 8(17), № 1, с. 34-40
== ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ ==
ВЛИЯНИЕ ГОРМОНОВ РЕПРОДУКЦИИ НА АКТИВНОСТЬ ИНДОЛАМИН-2,3-ДИОКСИГЕНАЭЫ МОНОЦИТОВ И ЭКСПРЕССИЮ FOXP3 В Т-РЕГУЛЯТОРНЫХ ЛИМФОЦИТАХ
© 2014 г. И.В. Некрасова, С.В. Ширшев
ФГБУНИнститут экологии и генетики микроорганизмов УрОРАН, г. Пермь, Россия Поступила: 27.11.2013. Принята: 21.01.2014
Впервые исследовано совместное влияние эстрадиола (Е2), эстриола (Е3), прогестерона (Pr), хорионического гонадотропина (ХГ) и лептина в комбинациях, характерных для I и III триместров беременности, на активность индоламин-2,3-диоксигеназы (IDO) моноцитов, индуцированную ЛПС и IFN-y, а также на экспрессию маркеров Т-регуляторных лимфоцитов (Treg) у небеременных женщин. Показано, что все исследуемые гормоны, за исключением ХГ, по отдельности обладают стимулирующим действием в отношении IDO, а в комбинации данный эффект нивелируется. Эстрогены и ХГ, в отличие от Pr и лептина, способствуют повышению процента CD4+FOXP3+ лимфоцитов. При этом продемонстрировано участие сигнального пути с вовлечением протеинкиназы A(PKA) в формировании данной субпопуляции, а также в реализации стимулирующих эффектов ХГ, Е2 и Е3. Комбинации всех пяти исследуемых гормонов, вне зависимости от триместров беременности, также способствуют увеличению содержания Treg. Таким образом, результаты данной работы свидетельствуют о том, что самостоятельные эффекты гормонов могут как суммироваться, так и исчезать при их совместном воздействии на клетки.
Ключевые слова: эстрогены, прогестерон, хорионический гонадотропин, лептин, индо-ламин-2,3-диоксигеназа, Т-регуляторные лимфоциты
ВВЕДЕНИЕ
Иммунные механизмы, функционирующие при беременности, направлены на обеспечение выживания и успешного формирования плода. В свою очередь, активность лейкоцитов эффективно регулируется со стороны эндокринной системы [1]. Важную роль при беременности играют женские половые гормоны — эстрогены и прогестины, а также регуляторы их секреции — хорионический гонадотропин (ХГ) и лептин, синтезируемые плацентой. Учитывая одновременную продукцию данных стероидных и пептидных гормонов, необходимо принимать во внимание их синергизм и антагонизм [1]. Следовательно, для создания адекватной картины требуется оценить их иммуноре-
Адрес: 614081, г. Пермь, ул. Голева, 13, ИЭГМ УрО РАН, Некрасовой И.В. E-mail: nirina5@mail.ru
гуляторные эффекты при совместном действии на клетки иммунной системы.
Анатомическое разделение матери и плода и антигенная незрелость фетального трансплантата не могут полностью объяснить его выживание. В качестве основного механизма формирования толерантности при беременности рассматривается усиление активности индоламин-2,3-диоксигеназы (IDO) и Т-регуляторных лимфоцитов (Treg) [2]. Поскольку IDO экспрессируется клетками синцитиотрофобласта человека и системная концентрация триптофана падает во время нормальной беременности, была высказана гипотеза, что экспрессия IDO на материн-ско-фетальной границе раздела является необходимой для предотвращения иммунологического отторжения плода. Активность IDO также может усиливаться при контакте с Treg-клетками — субпопуляцией лимфоцитов, которым принадлежит существенная роль в регуляции материнского иммунного ответа во время беременности [3]. В насто-
ящее время считается доказанным, что Treg поддерживают иммунологическую толерантность, участвуют в подавлении иммунного ответа на его заключительных стадиях, а также предотвращают развитие аутоиммунных заболеваний и отторжение трансплантата [4].
Целью данной работы явилось исследование влияния эстрадиола (Е2), эстриола (Е3), прогестерона (Pr), ХГ, лептина, а также их комбинаций, соответствующих I и III триместрам беременности, на активность IDO моноцитов и индукцию адаптивных Treg (aTreg).
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Объекты исследования
В работе использованы сепарированные лейкоциты периферической венозной крови здоровых небеременных женщин репродуктивного возраста (n = 8). Для выделения мононуклеаров периферической крови (МПК) использовали градиент плотности фиколл-верографина («Pharmacia», Швеция; «Спофа», Чехия) — 1,077. Кровь центрифугировали 40 мин при 1700 об/мин.
Гормоны и ингибиторы
Гормоны использовали в концентрациях, отражающих их уровни в крови, соответственно, в I и III триместры беременности: ХГ (Profasi, «I.F.Serono S.p.A.», Италия) использовали в концентрациях 10 и 100 МЕ/ мл [5]; Pr («Sigma», США) - 20 и 100 нг/мл [6]; Е2 («Sigma», США) - 1 и 10 нг/мл [6]; Е3 («Biomedicals, Inc.», Германия) — 2 и 20 нг/мл (6); лептин («Sigma», США) — 10 и 35 нг/мл [7].
Гормоны вносили в пробы по отдельности и в физиологических сочетаниях, характерных для указанных триместров беременности, а именно: I триместр — ХГ 100 МЕ/мл + Е2 1 нг/мл + Е3 2 нг/мл + Pr 20 нг/мл + лептин 10 нг/мл, III триместр — ХГ 10 МЕ/ мл + Е2 10 нг/мл + Е3 20 нг/мл + Pr 100 нг/ мл + лептин 35 нг/мл. В качестве контроля использовали официнальные растворители гормонов.
Для оценки внутриклеточной трансдукции сигнала в некоторых пробах использовался ингибитор протеинкиназы А (РКА) Н-89 дигидрохлорид («LC Laboratories», США) в концентрации 5 мкг/мл [8].
Оценка активности индоламин-2,3-диоксигеназы
Активность IDO определяли спектрофото-метрически [9]. Поскольку без стимулятора активность IDO в моноцитах практически не детектируется, для стимуляции МПК используются IFN-y («Вектор Бест», Россия) в концентрации 10 нг/мл [9] и липополисаха-рид (ЛПС) («Sigma», США) в концентрации 100 нг/мл [10], МПК культивировали в среде Хенкса, содержащей 100 мкМ триптофана («Sigma», США), в течение 4 часов. Затем в супернатантах определяли концентрацию кинуренина — первого стабильного метаболита пути распада триптофана. Для этого к 100 мкл клеточного супернатанта добавляли 50 мкл 30% трихлоруксусной кислоты, встряхивали и центрифугировали в течение 5 мин. при 10000 об/мин. Затем в лунки планшета вносили 75 мкл супернатанта, смешивали с равным объемом реактива Эрлиха (100 мг п-диметилбензальдегида, 5 мл ледяной уксусной кислоты). Оптическую плотность измеряли при длине волны 492 нм на многоканальном спектрофотометре Biohit BD 800 («Bio-Tek Instruments, Inc.», США). Для определения концентрации кинуренина в пробах строили кривую по калибровочным пробам 0—100 мкМ кинуренина («Sigma», США).
Фенотипирование Treg лимфоцитов
МПК культивировали с гормонами в среде 199 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 1 мМ HEPES, 2 мМ L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина в течение суток в условиях 5% СО2. После этого на проточном цитофлуориметре («Becton Dickinson», США) с использованием стандартной процедуры поверхностного и внутриклеточного окрашивания моноклональ-ными антителами (Primary Anti-Human CD4, Primary Anti-Human FOXP3, «Biolegend», США) в гейте лимфоцитов оценивали уровень CD4 + FOXP3+ Treg клеток.
Статистическая обработка экспериментальных данных
Полученные результаты обсчитывали с помощью программы «Excel» (версия 7.0 для Windows). При этом вычисляли среднюю арифметическую величину и ее стан-
дартную ошибку (M±m). Поскольку во всех тестах выборочное распределение было нормальным, а сравниваемые контрольная и опытные пробы взяты из одного пула клеток (от одного донора), достоверность различий между средними величинами оценивали согласно парному i-критерию Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ
беременности, тоже повышали уровень ки-нуренина в пробах. В обоих вариантах стимуляции активности IDO ХГ статистически достоверного влияния не оказал.
Несмотря на то, что эстрогены, прогестерон и лептин проявляют самостоятельные стимулирующие эффекты в отношении IDO, при совместном действии всех пяти исследуемых гормонов данное влияние нивелируется (табл. 1).
Влияние гормонов репродукции на активность IDO
При стимуляции клеток IFN-y концентрация кинуренина, а следовательно, и активность IDO повышалась под воздействием обеих исследуемых концентраций Е2, концентрации Е3, соответствующей III триместру беременности, а также комбинации стероидных гормонов, характерной для I триместра беременности (табл. 1).
При активации МПК ЛПС стимулирующим действием в отношении IDO обладали Е2, Е3 и Pr (табл. 1). При этом эффект был статистически значим вне зависимости от концентраций гормонов. Лептин в концентрации, соответствующей III триместру беременности, а также комбинация стероидных гормонов, соответствующая I триместру
Изменение процентного содержания СВ4+РОХР3+ клеток под воздействием гормонов репродукции
Установлено повышение процента СБ4 + РОХР3 + клеток под действием ХГ, Е2 и Е3 вне зависимости от используемых концентраций (табл. 2). При этом лептин в концентрации, соответствующей I триместру беременности, понижал уровень СБ4 + РОХР3 + лимфоцитов (табл. 2). Действие Рг, равно как и сочетаний стероидных гормонов, не было статистически значимым. Комбинации всех пяти исследуемых гормонов, характерные как для I, так и для III триместров беременности, также способствовали увеличению содержания Тгед.
В ходе исследования установлено снижение процентного содержания СБ4 + РОХР3 +
Таблица 1. Модуляция активности IDO под влиянием гормонов репродукции
Гормональное воздействие n Концентрация кинуренина, M
стимулятор ЛПС стимулятор IFN-y
Контроль 8 7,14 i 0,516 5,03 i 0,549
ХГ (100 ME/мл) 8 8,29 i 1,053 4,91 i 0,235
ХГ (10 ME/мл) 8 8,96 i 1,440 5,04 i 0,379
Лептин (10 нг/мл) 8 7,72 i 0,655 5,43 i 0,367
Лептин (35 нг/мл) 8 10,47 i 1,852* 5,73 i 0,441
E2 (1 нг/мл) 8 9,92 i 1,081* 6,10 i 0,469*
E2 (10 нг/мл) 8 10,33 i 0,810* 7,42 i 0,512*
E3 (2 нг/мл) 8 9,16 i 0,639* 5,50 i 0,317
E3 (20 нг/мл) 8 10,54 i 0,449* 8,42 i 0,974*
F3 (20 нг/мл) 8 12,77 i 1,643* 6,22 i 0,557
Fr (100 нг/мл) 8 11,22 i 1,301* 6,65 i 1,125
E2 (1 нг/мл) + E3 (2 нг/мл) + Fr (20 нг/мл) 8 12,18 i 1,363* 7,49 i 1,134*
E2 (10 нг/мл) + E3 (20 нг/мл) + Fr (100 нг/мл) 8 6,91 i 0,722 5,78 i 0,599
ХГ (100 ME/мл) -3 Лептин (10 нг/мл) + E2 8 8,02 i 0,606 6,28 i 0,833
(1 нг/мл) + E3 (2 нг/мл) + Fr (20 нг/мл)
ХГ (10 ME/мл) + Лептин (35 нг/мл) + E2 8 7,95 i 1,203 7,04 i 1,226
(10 нг/мл) + E3 (2
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.