АГРОХИМИЯ, 2014, № 8, с. 63-71
УДК 631.87:631.41 7:579.222.4
ВЛИЯНИЕ ГУМИНОВОГО КОМПЛЕКСА ПРЕПАРАТА ГУМИКОМ НА ОКИСЛЕНИЕ ОРГАНИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ БАКТЕРИАЛЬНОЙ КУЛЬТУРОЙ Gluconobacter oxydans
© 2014 г. Е.В. Емельянова1, А.А. Савинов2, Е.А. Михина2, И.В. Шемонаев3, А.А. Макаренко3, А.Н. Решетилов1
1Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН 142290 Московская область, Пущино, Проспект Науки, 5, Россия E-mail: elenvem@ibpm.pushchino.ru 2Самарский государственный университет 443011 Самара, ул. Акад. Павлова, 1, Россия 3ООО "Эмульсионные технологии " 443066 Самара, ул. Советской Армии, 107, Россия
Поступила в редакцию 10.12.2013 г.
Исследовано влияние гуминового комплекса препарата "Гумиком" на окисление органических веществ иммобилизованными клетками Gluconobacter oxydans ВКМ В-1280 с использованием сенсорной методики. Показано, что в зависимости от концентрации гуматов, действующих на растущие или на покоящиеся клетки, гуминовые вещества оказывали ингибирующий или стимулирующий эффект на окисление органических соединений бактериями. Это проявлялось в повышении или снижении реакции биосенсора, сформированного на основе бактериальных клеток, подвергшихся действию гуминовых соединений.
Ключевые слова: гуминовый комплекс, препарат гумиком, окисление органических веществ, бактериальная культура, Gluconobacter oxydans.
ВВЕДЕНИЕ
Парниковые газы - Н20, С02, СН4 - непрозрачны для теплового излучения, направленного от поверхности Земли, и ответственны за возникновение парникового эффекта. Эмиссия парниковых газов с поверхности почв в первую очередь связана с процессами трансформации и минерализации гуминовых веществ и органического вещества почв в целом [1, 2].
Одним из наиболее крупных и практически неисчерпаемых источников органического углерода как в наземных экосистемах, так и в биосфере являются гуминовые вещества (ГВ) [3] -обязательные участники малого биологического круговорота наземных и водных экосистем; их минерализация под действием микроорганизмов почвы сопровождается выбросом СО2 в атмосферу. Ускоренная минерализация органического вещества почвы, в том числе и гуминовых веществ, связана не только с усилением ферментативной активности почвенных микроорганизмов, но
определяется взаимосвязью между окислением ГВ и органических веществ почвы.
В процессе жизнедеятельности растения выделяют в почву разнообразные органические вещества (корневые выделения). Корневые выделения содержат различные углеводы, органические кислоты, аминокислоты, ферменты [4]. Эти вещества активно воздействуют на почву и способны изменять ее химический состав [5, 6]. Поступление в почву легкодоступных органических веществ создает условия для ко-метаболизма органического вещества почвы, усиливает минерализационные процессы. Был изучен прайминг-эффект, вызванный внесением доступного субстрата - глюкозы, для микробных сообществ почвы [7]. Прайминг-эффектом называются изменения в разложении органического вещества почвы, вызванные внесением органических или минеральных соединений [8, 9]. При внесении свежего субстрата происходят кратковременные изменения в оборачиваемости органического вещества почвы [10], минерализация запасов гумуса и ускорение выделения
СО2 из почвы. В лабораторных условиях прай-минг-эффект, инициированный внесением глюкозы, составлял 119-286% относительно внесенного углерода [7]. Таким образом, процессы окисления микроорганизмами гуминовых веществ и органического вещества почвы в целом взаимосвязаны. Процессы, происходящие в этом гигантском резервуаре углерода, оказывают влияние на климат планеты и требуют детального исследования.
При изучении взаимосвязи окисления ГВ и органических веществ широко применяют традиционные методологические подходы - методы биологического тестирования. Авторы данной статьи использовали новую методику при решении указанной проблемы - биосенсорную методику [11, 12], ранее не используемую.
Установлено, что гуминовые вещества, поступая в растения, усиливают электронно-транспортные процессы при дыхании растительных клеток, активируют оксидоредуктазные ферментные системы, влияют на рост дрожжей и почвенных микроорганизмов [13-16], т.е. тем или иным образом влияют на интенсивность дыхания организмов. Поэтому для исследования авторами был использован биосенсор на основе кислородного электрода Кларка и иммобилизованных клеток аэробных бактерий ОЫсопоЬа^ет охуёат ВКМ В-1280. Этот биосенсор позволяет регистрировать дыхательную активность бактериальных клеток. Для бактерий рода О1исопоЬа&ег типичными субстратами являются углеводы и спирты; большинство этих соединений окисляется под действием локализованных в мембране дегид-рогеназ, связанных с дыхательной цепью бактерий [17]. Поэтому интенсивность дыхания культуры изменяется в присутствии органических веществ, выступающих в качестве субстратов дыхания. Сенсор на основе клеток О. охуёат регистрирует изменения в дыхании культуры (потребление кислорода) при окислении ею органических веществ. Изменение интенсивности окисления веществ, которое происходило бы в присутствии ГВ, должно было отразиться на дыхательной активности бактериальных клеток и могло быть зафиксировано с помощью сенсора.
Гуминовые вещества - это высокомолекулярные азотсодержащие соединения. В них установлено наличие фенольных гидроксилов, карбоксильных, карбонильных и ацетогрупп; в состав гумусовых кислот входят гуминовые кислоты, фульвокислоты, гиматомелановые кислоты. Такие сложные по химическому составу и строению соединения не могут не обладать двояким эффектом на живую клетку. В зависимости от условий
они оказывают, по данным литературы, как положительное, так и отрицательное воздействие. По данным работы [16], содержание гуминовых кислот в почвенных и поверхностных водах близко к их концентрациям в растворе 0.1-1 мг/л. В настоящей работе было исследовано влияние препарата гумиком в различных концентрациях от 0.0001 до 0.1% по ГВ.
К важнейшим функциям гуминовых веществ относятся аккумулятивная (накопление в форме ГВ элементов питания, необходимых и усваиваемых микроорганизмами или растениями), физиологическая (прямое влияние гуминовых соединений на растения и микроорганизмы) [3, 18].
Цель работы - исследовать влияние гуминового комплекса препарата гумиком на окисление органических веществ иммобилизованными клетками Gluconobacter oxydans ВКМ В-1280, используя сенсорную методику.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Для достижения поставленной цели была использована лабораторная модель биосенсора. Биорецептором в ней служили клетки Gluconobacter oxydans ВКМ В-1280, иммобилизованные методом физической сорбции на хроматографической стеклобумаге ("Whatman GF/A", Великобритания), преобразователем - кислородный электрод типа Кларка (ООО "Кронас", Россия), который позволяет фиксировать скорость изменения концентрации кислорода с помощью потенциостата IPC-Micro (ООО "Кронас", Россия), интегрированного с персональным компьютером. Регистрируемым параметром являлась максимальная скорость изменения выходного сигнала dI/dt (нА/с), связанная пропорциональной зависимостью со скоростью изменения концентрации потребленного клетками кислорода (в дальнейшем - ответ биосенсора).
Для формирования рецепторного элемента культуру G. oxydans ВКМ B-1280 выращивали на жидкой питательной среде, содержащей (г/л): сорбит - 200, дрожжевой экстракт - 2. Контрольный вариант - концентрация ГВ в ростовой среде, равная 0%. В зависимости от целей эксперимента в ростовую среду вносили препарат гумиком в количестве, обеспечивающем содержание ГВ в ростовой среде от 0.1 до 0.0001%. Опытный вариант - присутствие ГВ в ростовой среде. Клетки выращивали в течение 18 ч, что соответствовало стационарной фазе роста бактерий. Культивирование осуществляли в колбах Эрленмейера
объемом 750 мл, содержащих 100 мл ростовой среды, при перемешивании на качалке (200 об/мин) при температуре 28°С. Биомассу отделяли центрифугированием при 10000 g в течение 5 мин и отмывали дважды калий-фосфатным буфером (30 мМ, рН 6.6). Полученную биомассу суспензировали в аналогичном буфере до концентрации 100 мг/мл по сырому весу.
Для иммобилизации клеток методом физической сорбции 5 мкл полученной клеточной суспензии наносили на фрагмент Whatman GF/A размером 3 х 3 мм2. Сформированный рецептор-ный элемент подсушивали при комнатной температуре в течение 20 мин и фиксировали на измерительной поверхности кислородного электрода Кларка с помощью нейлоновой сетки. Электрод помещали в открытую кювету объемом 2 мл, содержащую буферный раствор, и проводили измерения. В зависимости от целей эксперимента биорецептор также выдерживали в буфере в течение 18 ч (контроль - инкубирование биорецептора при концентрации гуматов 0%) или инкубировали в течение 18 ч в буферном растворе, содержащем препарат гумиком (опыт - инкубирование биорецептора в присутствии ГВ). Концентрации препарата в буферном растворе составляли: 0.0001, 0.001, 0.01 и 0.1%.
Все измерения проводили в 30 мМ калий-фосфатном буферном растворе рН 6.6, насыщенном кислородом воздуха, при комнатной температуре и постоянном перемешивании раствора с помощью магнитной мешалки (скорость перемешивания раствора - 400 об/мин). Объем вводимого субстрата -100 мкл. Каждое измерение проводили в трехкратной повторности. Отклонение от средней величины на диаграммах - доверительный интервал.
Для исследования окисления органических веществ иммобилизованными клетками Glucono-bacter oxydans ВКМ В-1280 использовали: водные растворы глюкозы и этанола в концентрации 0.5 мМ; водные растворы арабинозы, ксилозы, сорбита, глицерина, метанола и уксусной кислоты в концентрации 10.0 мМ, что определялось чувствительностью бактериальных клеток.
Чтобы выявить влияние ГВ на процессы окисления органических соединений культурой Gluconobacter oxydans, бактериальные клетки подвергли действию гуминовых соединений на стадии выращивания культуры (растущие клетки) или инкубировали в растворе ГВ уже сформированный рецепторный элемент (покоящиеся клетки).
Для выяснения влияния препарата гумиком на растущие клетки культуру в
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.