МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 6, с. 741-750
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 582.282.22.[042.5+083.3]
ВЛИЯНИЕ ХИМИЧЕСКОГО АНАЛОГА МИКРОБНЫХ АУТОИНДУКТОРОВ АНАБИОЗА НА Са2+-ОТВЕТ МИЦЕЛИАЛЬНЫХ ГРИБОВ
© 2004 г. О. В. Козлова*, Ф. Г. Куприянова-Ашина**, С. Ю. Егоров**, Г. И. Эль-Регистан***
*Эдинбургский университет, г. Эдинбург **Казанский государственный университет, Казань ***Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва Поступила в редакцию 20.04.03 г.
Обнаружено участие микробных алкилоксибензолов (АОБ) - аутоиндукторов анабиоза (факторов dx), в формировании стрессового ответа мицелиальных грибов, о чем судили по изменению концентрации внутриклеточного Са2+. С использованием генетически модифицированного штамма Aspergillus awamori 66 A, содержащего рекомбинантный Са2+-зависимый белок экворин, была изучена динамика Са2+ в цитозоле клеток, подвергаемых механическому шоку в присутствии протекторных доз (0,001-0,01% в/об) химического аналога АОБ - 4-н-гексилрезорцина. Установлено, что повышение уровня АОБ в развивающейся культуре грибов воспринимается клетками как сигнал о стрессовой ситуации, вызывая увеличение в цитозоле концентрации Са2+. Характер отклика, который определяли по величине амплитуды люминесценции, соответствующей концентрации Са2+ в цитозоле, зависел от физиологического возраста клеток и концентрации АОБ. Обнаружено, что пре-динкубация микромицетов с АОБ защищала клетки от последующего стрессорного воздействия, что отражалось в изменении Са2+-ответа. Протекторный эффект АОБ фиксировался как: 1) значительное уменьшение амплитуды люминесценции, соответственно, накопления в цитозоле Са2+ при последующем механическом стрессе (по сравнению с контролем - только механический стимул); 2) развитие вторичного Са2+-ответа, не имевшего места в контроле; 3) длительное поддержание высокого уровня Са2+ в цитозоле в присутствии АОБ (по сравнению с контролем, без прединкубации с АОБ). Обсуждаются возможные механизмы влияния АОБ на Са2+-транспортные процессы.
Ключевые слова: стресс, защита от стресса, алкилоксибензолы, мицелиальные грибы, Aspеrgillus awamori, рекомбинантный экворин, динамика Са2+.
Известно, что изменения концентраций внутриклеточного Са2+ играют важную роль в регуляции всех физиологических процессов, происходящих в клетках - росте, делении, возбудимости, секреции, образовании покоящихся форм у микроорганизмов и апоптозе у многоклеточных. Повышение уровня Са2+ вследствие изменений в кальциевой регуляции является характерным показателем оксидативного стрессового состояния клеток, которое развивается в ответ на практически любые стрессорные воздействия [1].
В клетках эукариот пул цитозольного Са2+ создается двумя потоками: поступлением из среды роста и из клеточных органелл, являющихся его резервуарами. И в том, и в другом случае транспорт Са2+ обеспечивается работой мембранных кальциевых каналов и потому зависит от структурного и функционального состояния мембран и канальных белков.
В связи с изложенным, интерес представляло изучение влияния на аккумуляцию внутриклеточ-
ного Са2+ (в стрессовой ситуации) ауторегулятор-ных факторов (ф^), представленных у некоторых бактерий и дрожжей производными алкилоксибензолов [2, 3], и обладающих мембранотропной активностью [4, 5] и свойствами химических ша-перонов [6], согласно терминологии Гекко [7].
Механизм действия АОБ основан на их способности за счет лабильных физико-химических взаимодействий: межмолекулярных водородных связей, гидрофобных и электростатических взаимодействий, изменять степень микровязкости клеточных мембран [4, 5], а также модифицировать пространственную структуру биомакромолекул, в том числе ферментных белков [5, 6], обуславливая этим повышение их стабильности с одновременным изменением функциональной активности [5-7].
Отметим, что стационарные и, особенно, покоящиеся клетки, в контроле образования которых принимают участие АОБ, характеризуются повышенной устойчивостью к неблагоприятным (стрессорным) воздействиям (температурному и
pH-шоку, УФ-облучению и др.). Методом рентгеновского микроанализа было показано, что другой характеристикой, сопряженной с устойчивостью стационарных и покоящихся клеток бактерий и дрожжей, является повышенное содержание в них Са2+ (по сравнению с пролиферующими клетками) [8].
Учитывая вышеперечисленные свойства и контролируемые ими биологические эффекты, объяснима видонеспецифичность участия этих ауторегуляторов в развитии стрессового ответа клеток организмов разного уровня организации, не только микроорганизмов [9], но и животных клеток [10]. Поэтому представлялось логичным и целесообразным исследовать влияние АОБ на пул внутриклеточного Са2+ у мицелиальных грибов в стрессовой ситуации. Особый интерес представляли подобные исследования в отношении микромицетов, для которых регуляция формирования Са2+-ответа плохо изучена. Выбор этих микроорганизмов как тест-объектов был обусловлен также возможностью использования Aspergillus awamori 66А - мутантного штамма с рекомбинант-ным фотобелком - экворином, эмиссия фотонов которого зависит от концентрации внутриклеточного (цитозольного) Са2+ [11]. Использование рекомбинантного экворина позволяет не только определять количество свободного внутриклеточного Са2+, но и проследить динамику Са2+-ответа.
Целью настоящей работы явилось изучение влияния химического аналога фё1 (4-н-гексилре-зорцина) на развитие Са2+-ответа клеток Aspergillus awamori при стрессорных воздействиях.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Эксперименты проводили со штаммом Aspergillus awamori 66А, любезно предоставленным лабораторией исследования клеток микромицетов Эдинбурского университета. A. awamori представляет собой мутантный штамм, в котором экс-прессирован фотобелок экворин [11]. Микроми-цеты выращивали в жидкой среде Вогеля [12] с добавлением 1% сахарозы при температуре 30°C в течение 72 ч в 96-клеточных матрицах. В каждую ячейку матрицы вносили 100 мкл споровой суспензии с концентрацией спор 5 х 105 кл/мл.
Микромицеты подвергали механическому шоку путем "взбалтывания" развивающихся культур на шейкере (120 об/мин) в течение 5 мин.
В работе использовали один из химически синтезированных алкилоксибензолов - 4-н-гексил-резорцин ("Serva"). АОБ вносили в виде раствора в этаноле. Конечная концентрация этанола составляла 0.016%. Внесение растворов АОБ осуществляли с помощью встроенных в люминометр инжекторов.
Фотобелок экворин, эксспрессированный в A. awamori, при взаимодействии с Са2+ распадается на апоэкворин и хромофор - селентрамид, что сопровождается эмиссией света, интенсивность которого зависит от уровня цитозольного Са2+. Реконструкцию белка экворина осуществляли добавлением в культуру в каждой ячейке матрицы метанольного раствора селентразина в количестве 40 мкл с конечной концентрацией хромофора 2.5 мкМ. Раствор селентразина готовили непосредственно перед его внесением в клеточную суспензию.
Измерения испускаемого света осуществляли с помощью люминометра (EG&G Berthold LB96P Microlumat), оснащенного фотоумножителем и приспособленного к измерению люминисценции клеток в 96 ячейках матрицы.
Интенсивность люминисценции, коррелирующей с уровнем цитозольного свободного Са2+, измеряли в относительных световых единицах (ОСЕ). Для пересчета на величину концентрации Са2+ была использована эмпирически полученная формула:
pCa = 0.332588 (-lgk) + 5.5593;
где к - отношение люминисценции в конкретный момент времени к общей максимальной люминисценции [13]. Общую максимальную люминис-ценцию определяли как величину, полученную при разложении всего имеющегося в клетке экворина, что происходило при добавлении в клеточную суспензию CaCl2 до конечной концентрации 1.5 М. Эксперименты проводили в пятикратной повторности, при обработке полученных результатов применяли метод вариационно-статистического анализа с использованием критерия достоверности P < 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
В проводимых ранее работах было показано, что повышение уровня внеклеточных АОБ в развивающихся культурах бактерий и дрожжей в стрессовых условиях, в частности, вследствие исчерпания источников питания (starvation stress) [14, 15] или при других неблагоприятных воздействиях, обуславливает существенное увеличение в клетках Са2+ [16]. Аналогичные изменения ионного гомеостаза клеток наблюдали при внесении экзогенных АОБ в суспензии микроорганизмов [8]. Поэтому в первой части настоящей работы было исследовано собственное влияние АОБ, вносимых в разных концентрациях (0.001 и 0.01%), на формирование Са2+-ответа клеток мицелиальных грибов. Ответ фиксировали по характеру и интенсивности люминисценции клеток 24- (фаза экспоненциального роста) и 72-часовых (стационарная фаза) культур A. awamori (рис. 1, 2). Контролем служили культуры гриба, подвергнутые механическому стрессорному воздействию (взбалтывание сус-
Концентрация кальция, мкМ
Время, мин
Рис. 1. Динамика ионов Са2+ в клетках A. awamori (24 ч) при внесении в культуру АОБ в концентрациях: 1 - контроль (0%); 2 - 0.001; 3 - 0.01%.
Концентрация кальция, мкМ
Время, c
Рис. 2. Динамика ионов Са2+ в клетках A. awamori (72 ч) при внесении в культуру АОБ в концентрациях: 1 - контроль (0%); 2 - 0.001; 3 - 0.01%.
Концентрация кальция (сумма), мкМ 160
140 120 100 80 60 40 20 0
Контроль АОБ,
0.001%
АОБ
0.01%
Рис. 3. Аккумуляция Са2+ клетками А. ан>ашоп, стимулированная внесением АОБ, в зависимости от возраста культуры: 1 - 24; 2 - 72 ч.
пензии), которое индуцировало повышение уровня Са2+ в клетках, что было показано в нашей предыдущей работе [16]. Как показано на рис. 1 и 2 в обоих, в контрольном и опытном, вариантах через 1 мин после воздействия (взбалтывание или внесение АОБ) в клетках скачкообразно возрастала концентрация Са2+. Из этого следует, что клетки реагировали на повышение уровня внеклеточных АОб как на сигнал о стрессовой ситуации. Характер ответа - амплитуда люминисцен-ции и, соответственно, количество Са2+ в цитозо-ле - зависел от физиологического возраста клеток и концентрации экзогенных АОБ. Реакция клеток экспоненциальной культуры на внесение 0.001% АОБ
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.