ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 50, № 1, с. 95-100
УДК 581.14:577.114:633.11
ВЛИЯНИЕ ХИТООЛИГОСАХАРИДОВ РАЗЛИЧНОЙ СТЕПЕНИ АЦЕТИЛИРОВАНИЯ НА АКТИВНОСТЬ ПАТОГЕН-ИНДУЦИРУЕМОЙ АНИОННОЙ ПЕРОКСИДАЗЫ ПШЕНИЦЫ
© 2014 г. И. В. Максимов, А. Ш. Валеев, Е. А. Черепанова, Г. Ф. Бурханова
Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН, Уфа, Россия, 450054
e-mail: phyto@anrb.ru Поступила в редакцию 15.04.2013 г.
Изучено влияние хитиновых олигосахаридов (ХОС) с молекулярной массой 5—10 кДа и степенью ацетилирования (СА) 65 и 13% в концентрации 1.0 мг/л на экспрессию гена TC151917, кодирующего анионную пероксидазу пшеницы и активность "анионных" изопероксидаз в растениях мягкой пшеницы, инфицированных возбудителем септориоза Septoria nodorum Berk. Обработка ХОС с СА 65% и инфицирование индуцировали активность транскрипции гена пероксидазы TC151917 и повышение ферментативной активности анионной пероксидазы с pI 3.5 в растворимой и ионно-свя-занной с клеточными стенками фракциях. ХОС с СА 13% изменяли отмеченные параметры в меньшей степени. Полученные данные говорят о важности степени ацетилирования ХОС в развитии иммунного ответа растений пшеницы с участием пероксидаз.
DOI: 10.7868/S0555109913060123
Низкомолекулярные формы хитиновых оли-гомеров (ХОС) могут индуцировать в растениях синтез широкого спектра белков, формирующих устойчивость к патогенам. Так, у растений Arabi-dopsis thaliana выявлено более 60 генов, быстро (в течение 10—30 мин после воздействия) реагирующих на их добавление [1, 2]. Среди них наибольшей активностью транскрипции в этих условиях обладали гены, кодирующие митоген-активируе-мые протеинкиназы, малатдегидрогеназу, цито-хром монооксигеназу, лектин-подобные белки, хи-тиназы, Р-глюканазы, фенилаланинаммиак-лиазу, халконсинтазу, пероксидазу, ингибиторы протеи-наз [3—6].
Обнаружена важная роль степени ацетилирования (СА) хитина в индукции развития защитных реакций растительных клеток [7]. Так, если ацетилированные ХОС вызывали значительный иммунный ответ клеток Araucaria angustifolia пшеницы, ячменя и риса против ряда патогенов, в сравнении с неацетилированными формами [3, 4, 6, 8—10], то для контроля развития серой гнили на растениях огурца, картофеля, арабидопсиса и томатов, напротив, были эффективны низко ацети-лированные его формы [11, 12].
Одним из ферментов, быстро отвечающих на появление элиситоров, является пероксидаза, в особенности ионно-связанная с клеточной стенкой, которая может концентрироваться в зоне инфицирования. Причем экспериментально доказано, что наиболее эффективными индукторами процесса лигнификации в растениях, где активно участвуют пероксидазы, являются ХОС с
СА не менее 35% [4]. Основываясь на этих фактах, нами проанализированы некоторые элементы защитных реакций растений с участием анионных пероксидаз, предполагающие их способность взаимодействовать с клеточной стенкой грибных патогенов, в том числе с одним из ее важных компонентов — хитином [13].
Цель работы — изучение влияния степени ацетилирования ХОС на защитные свойства растений пшеницы в отношении возбудителя септориоза Septoria nodorum Berk, и сопряженные с этим процессы активации пероксидазы, индуцируемой патогеном.
МЕТОДИКА
Семена мягкой пшеницы Triticum aestivum L. (сорт Жница) обрабатывали 70%-ным этанолом, промывали водой и замачивали (3 ч) в растворе препаратов ХОС (1.0 мг/л) с молекулярной массой 5—10 кДа и СА 65 и 13%, полученных из хитина крабов ("Fluka", Австрия) согласно методике, разработанной в нашей лаборатории [13]. СА ХОС предварительно определяли с использованием химического мультиметра Эксперт — 123456 (ООО "Эконикс-эксперт", Россия) и блока автоматического титрования БАТ-15.2МП (РУП "Гомельский завод измерительных приборов", Беларусь) [14]. Семена проращивали в течение 24 ч на влажной фильтровальной бумаге, затем проростки высаживали в кюветы со стерильным речным песком, переносили на светоплощадку с 16-часовым световым периодом и освещенностью 12—14 тыс. лк
и поливали раствором Кнопа. Полностью развернутые первые листья пшеницы 7-суточных проростков срезали, помещали в чашки Петри и прикрывали срезы влажной ватой, смоченной бензи-мидазолом [15]. Часть листьев инокулировали суспензией пикноспор агрессивного штамма гриба S. nodorum местной репродукции (106 спор/мл).
Выделение белков. Для выделения растворимой фракции пероксидазы растительный материал (масса навески—объем буфера 1 : 3) гомогенизировали в 0.01 М Na-фосфатном буфере рН 6.0 (ФБ) и экстрагировали фермент при 4°C, в течение 1 ч. Экстракт центрифугировали 15 мин при 15000 g на центрифуге "High speed centrifuge type 310 b" ("Mechanica precyzyjno", Польша).
Для выделения ионно-связанной фракции пе-роксидазы клеточные стенки листьев пшеницы, после их 10-кратного отмывания 0.01 М ФБ, содержащим 1.0%-ный тритон Х-100 (масса навески—объем ФБ — 1 : 10), подвергались обработке 2.0 М NaCl в 0.01 М ФБ (масса навески-объем буфера — 1 : 1). Образцы центрифугировали 15 мин при 15000 g. Все полученные образцы перед анализами подвергались диализу против 0.01 М ФБ и использовались для определения активности и изо-электрического спектра пероксидаз.
Определение активности. Активность пероксидазы определяли микрометодом. Для этого в лунки планшет для иммуноанализа ("Nunc", США) добавляли по 0.075 мл предварительно разбавленного в 0.01 М ФБ (об. образца : об. буфера, 1 : 50) фермента и 0.025 мл раствора о-фенилендиамина в концентрации 0.5 мг/мл. После добавления 0.025 мл 0.016%-ного Н2О2 развитие окраски останавливали через 2 мин добавлением 0.05 мл 4.0 н. H2SO4. Планшет сканировали при 490 нм на приборе для иммуноферментного анализа Benchmark Microplate Reader ("BioRad", США).
Изоэлектрофокусирование (ИЭФ) белковых экстрактов проводили на приборе фирмы "Хийу-Каллур" (Эстония) с использованием 7%-ного ПААГ и 2.5%-ных изолитов (ICN) изоэлектриче-ских точек (pi) от 3.0 до 10.0. Аликвоты суперна-тантов перед ИЭФ дополнительно диализовали против дистиллированной воды и выравнивали по содержанию белка в контрольном образце. Наличие изопероксидаз в геле после ИЭФ проявляли с использованием 0.01%-ного 3.3-диамино-бензидина солянокислого ("Chemapol", Чехия) в присутствии 0.001%-ного Н2О2 в 0.1 М ФБ. ПААГ после отмывки от не прореагировавшего субстрата фотографировали. На фотографиях представлена анионная часть спектра изопероксидаз пшеницы. Для определения pi изопероксидаз пшеницы использовали белки диагностического набора ("Sigma", США).
Выделение РНК. Выделение тотальной РНК из опытных растений и анализ активности транскрип-
ции гена пероксидазы проводили согласно методике, приведенной в работе Г.Ф. Бурхановой с соавт. [16]. Полимеразно-цепную реакцию (ПЦР) с использованием специфических к гену анионной пероксидазы праймеров F (5'-TTCGACAACAAG-TACTACTTCGA-3') и R (5'-CGGATCTCTC-CCGCGCTGC-3') проводили в амплификаторе типа ТП4-ПЦР-01-"Терцик" ("ДНК-Технология", Россия). Данные по активности гена пероксидазы нормализованы против активности транскрипции конститутивно экспрессирующегося гена "домашнего хозяйства" ("house-keeping") Р-актина пшеницы. Праймеры к гену актина имели следующую последовательность: ActF (5'-ATGTGGATAT-CAGGAAGGA-3') и ActR (5'-C-TCATACGGT-CAGCAATAC-3') [16].
Компьютерный анализ аминокислотных и нук-леотидных последовательностей генов пероксида-зы проводили с помощью пакета компьютерных программ Lasergene фирмы "Dnastar, Inc." (США).
Опыты ставили в 3-х повторностях. Каждая белковая фракция анализировалась на активность пероксидазы и содержание белка не менее 4 раз.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Давно замечено, что растения становятся устойчивыми к патогенам после их предварительной инокуляции слабоагрессивными штаммами или обработки иммунизаторами [17, 18]. Так, ранее нами отмечалось, что слабо агрессивные штаммы гриба S. nodorum индуцировали в инфицированных растениях пшеницы системы защиты от патогенов, в частности связанные с про-/антиоксидантной системой [19]. На рис. 1 показаны данные по влиянию ХОС с различной СА (65 и 13%) на развитие септориоза на отрезках листьев пшеницы. Как видно, ХОС с СА 65% индуцировали в растениях защиту от возбудителя септориоза S. nodorum более эффективно, в сравнении с ХОС со СА 13%.
Данные по влиянию ХОС и инфицирования возбудителем септориоза на активность пероксидазы в растворимой и ионно-связанной с растительными клеточными стенками форме, представлены в таблице. Под влиянием ХОС со СА 65% и инфицирования патогеном растения повышают активность растворимой пероксидазы по сравнению с инфицированными, но не обработанными вариантами или вариантами, обработанными ХОС с СА 13%. Олигомеры с СА 13% и инфицирование не вызывали значительной активации пероксидазы и в ионно-связанной фракции фермента. Следовательно можно предположить, что один из путей индукции защитного ответа растений пшеницы на грибную инфекцию с участием ХОС с СА 65% связан с модуляцией активности пероксидазы как в растворимой, так и связанной с клеточной стенкой формами.
ВЛИЯНИЕ ХИТООЛИГОСАХАРИДОВ РАЗЛИЧНОЙ СТЕПЕНИ АЦЕТИЛИРОВАНИЯ 97
норме и при инфицировании. В то же время при инфицировании растений, обработанных ХОС с СА 13%, активность этой изоформы хотя и индуцировалась, но в меньшей степени, чем после ХОС с СА 65% (рис. 2а).
В контрольных листьях фракция ионно-связан-ных с клеточными стенками анионных изоперок-сидаз были представлены изоферменты с р/ ~ 4.6 (рис. 2б). При инфицировании грибом S. по^гыш в клеточных стенках проявляли свою активность несколько изопероксидаз с р/ ~ 4.0—5.9 (рис. 2б). На фоне отсутствия в неинфицированных растениях обработанных ХОС с СА 65% значительных изменений в изоферментном спектре пероксидаз, инфицирование приводило к проявлению активности изопероксидаз с р/ ~ 3.5 в этой фракции белка (рис. 2б), что значительно отличалось от изофер-ментного спектра инфицированных контрольных растений пшеницы. Так, в этих образцах нами не выявлено активации изопероксидаз с р/ ~ 4.0—5.9. Важно заметить, что если в инфицированных листьях, обработанных ХОС с СА 65%, во внеклеточной фракц
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.