АГРОХИМИЯ, 2013, № 12, с. 3-9
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ Регуляторы роста растений
Этот номер журнала "Агрохимия" посвящен памяти Николая Николаевича Мельникова (1908-2000), 105-летие которого отмечено в 2013 г. В публикациях обсуждаются современные проблемы защиты растений, применения пестицидов, регуляторов роста и вопросы экологического мониторинга возбудителей болезней и вредителей сельскохозяйственных культур.
УДК 632.4:632.938:633.11
ВЛИЯНИЕ ХИТООЛИГОСАХАРИДОВ С РАЗЛИЧНОЙ СТЕПЕНЬЮ АЦЕТИЛИРОВАНИЯ НА АКТИВНОСТЬ ЗАЩИТНЫХ БЕЛКОВ В ЛИСТЬЯХ ПШЕНИЦЫ ПРИ ИНФИЦИРОВАНИИ ВОЗБУДИТЕЛЕМ СЕПТОРИОЗА
© 2013 г. Л.Г. Яруллина, Е.А. Заикина, А.Р. Ахатова, Р.И. Касимова
Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН 450054 Уфа, просп. Октября, 71, Россия E-mail: yarullina@bk.ru
Поступила в редакцию 25.06.2013 г.
При использовании метода полимеразно-цепной реакции (ОТ-ПЦР) изучали влияние хитоолигоса-харидов (ХОС) с различной степенью ацетилирования (СА) на экспрессию генов защитных белков (оксалатоксидазы, пероксидазы, ингибиторов протеиназ) в листьях пшеницы (Triticum aestivum L.), инфицированных возбудителем септориоза (Septoria nodorum Berk.). Оценивали развитие гриба на контрольных и предобработанных ХОС листьях пшеницы. Показано, что максимальную эффективность как в усилении экспрессии генов пероксидазы и оксалатоксидазы, так и в подавлении роста патогена в растительных тканях проявляли ХОС со СА 65%. В повышении экспрессии гена ингибиторов протеиназ, напротив, более значительным было влияние ХОС со СА 30%. Ключевые слова: хитоолигосахариды, степень ацетилирования, активность защитных белков, листья пшеницы, возбудитель септориоза.
ВВЕДЕНИЕ
Важное направление в защите растений - поиск экологически безопасных препаратов, действие которых основано на индукции естественных защитных механизмов растений. В последние годы достигнут значительный прогресс в исследовании механизмов формирования защитных реакций растений против фитопатогенов. В первую очередь это связано с обнаружением и практическим использованием элиситоров, индуцирующих запуск местных и системных защитных реакций растительного организма.
Показано, что эффективными элиситорами защитных реакций растений являются производные хитина [1]. С использованием ДНК-чипов у АтаЪ1ёорз1з ЛаНапа выявлено до 60 генов, реагирующих на добавление хитина [2, 3]. Среди них быстрой (10-30 мин) и высокой экспрессией характеризовались гены, ответственные за синтез
регуляторных белков, участвующих в транскрипции и передаче информации [3]. Весьма важным свойством препаратов на основе хитина и хитоза-на с точки зрения практического растениеводства является их рострегулирующая активность в низких концентрациях [4, 5].
Считается, что определенную роль в специфичности проявления биологической активности производных хитина имеет степень ацетилирования (СА) биополимера [6, 7]. Подтверждением этому является тот факт, что у патогенов обнаружены ферменты, изменяющие степень его ацети-лирования [8, 9].
Для разработки технологии использования препаратов на основе хитина необходимы сведения о связи его биологической активности со структурой биополимера, иначе можно получить вместо индукции защитного ответа его супрессию [10]. Одним из механизмов защитного действия низкомолекулярных производных хитина - хито-
олигосахаридов (ХОС) является активация генов, включающихся в синтез патоген-индуцируемых белков [11, 12]. К патоген-индцируемым белкам, которые характеризуются широким спектром физиологического действия, относятся пероксидаза (ПО) [13], оксалатоксидаза (ОхО) [14], ингибиторы протеиназ (ИП) растений [15].
Цель работы - уточнение роли степени ацети-лирования производных хитина в проявлении их биологической активности. В данной работе исследовали влияние ХОС со СА 30 и 65% на рост гриба S. nodorum и экспрессию генов ОхО, ПО, ИП в листьях пшеницы.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
В качестве объектов исследования были использованы проростки пшеницы T. aestivum L. сорта Жница. Полностью развернутые листья 7-суточных проростков пшеницы срезали, помещали во влажную камеру на фильтровальную бумагу, срезы прикрывали ватой, смоченной в растворе бензимидазола (40 мг/л). Отрезки листьев инокулировали суспензией пикноспор S. nodorum Berk. (106 спор/мл). Инокулированные листья выдерживали при комнатной температуре в темноте в течение 24 ч, после чего переносили на светоплощадку с фотопериодом 16 ч/сут [16]. Симптомы септориоза регистрировали в течение
14 сут после инокуляции листьев. Водорастворимые ХОС со степенью ацетилирования 30% и 65%, молекулярной массой 5-7 кД в концентрации 1 мг/л использовали для замачивания семян пшеницы (3 ч). Хитоолигосахариды 65% СА и 30% СА были приобретены в ЗАО "Сонат" (Москва). Через 24, 48 и 72 ч после инокуляции оценивали уровень экспрессии генов ПО, ОхО, ИП и активность кодируемых ими белков.
Растительный материал взвешивали и растирали в фарфоровой ступке с добавлением 0.05 М Na-фосфатного буфера (ФБ) рН 6.2 в соотношении 1 : 5 (1 часть растительного материала и 5 объемов ФБ). Для выделения цитоплазматиче-ской белковой фракции образцы экстрагировали в течение 30 мин при 4°С и центрифугировали при
15 000 об./мин, отбирали супернатант. Для определения пероксидазной активности супернатант разбавляли в 30-50 раз в ФБ рН 6.2 в пробирке (10 мкл образца на 290 мкл буфера) и переносили в лунки плоскодонных планшет для иммуноана-лиза ("Nunc", США) в следующем порядке: 75 мкл образца, 25 мкл 0.08%-ного ортофенилендиамина (ОФД) ("Реахим", Россия), 25 мкл 0.016%-ного Н2О2. Ферментативную реакцию останавливали 50 мкл 4 н. H2SO4. Оптическую плотность из-
меряли на приборе Benchmark Microplate Reader ("BioRad", США) для иммуноферментного анализа при 490 нм.
Активность оксалатоксидазы в изученных фракциях определяли микрометодом [17] в планшетах для иммуноферментного анализа. Реакционная среда содержала 100 мкл 0.05 М сукцинат-ного буфера рН 3.8, 30 мкл 0.025 М щавелевой кислоты ("Реахим", Россия), 30 мкл ферментативной вытяжки (50-100 мкг белка) и 50 мкл цветного реактива. Для получения цветного реактива использовали 0.05 М фосфатный буфер рН 7.0, 0.05%-ный ортофенилендиамин ("Реахим", Россия) и пероксидазу хрена ("ДиаэМ", Россия) (1 мг/мл). Планшет сканировали при длине волны 492 нм на фотометре ("Titertek Uniskan", Англия).
Активность ингибиторов протеиназ определяли по методике Гофмана-Вайсблая с некоторыми модификациями [18]. К 0.5 мл трис-НС1-буфера добавляли 1.0 мл экстракта и 0.5 мл фермента. Затем приливали 1.0 мл раствора Na-бензоил-DL-аргинин-4-нитроанилид HC1 ("Serva", США), после чего инкубировали на водяной бане 10 мин при 37°С, затем для прекращения реакции добавляли 0.5 мл 30%-ной уксусной кислоты ("Химре-активснаб", Россия). В качестве контроля служил раствор, состоящий из 0.5 мл трис-НС1-буфера, 1.0 мл дистиллированной воды, 1.0 мл экстракта, 0.5 мл 30%-ной уксусной кислоты ("Химре-активснаб", Россия) и 0.5 мл раствора фермента. В параллельных опытах, в которых определяли активность протеиназ, вместо испытуемого раствора добавляли воду. Оптическое поглощение полученного раствора определяли на фотоколориметре Labsystems Uniskan ("Labsystems", Финляндия) при длине волны 405 нм.
Активность фермента с ингибиторами и без них определяли по формуле:
A =
(Eф - Eоп) $ V t ■ V1 $ 0.00955
где:
А - активность ферментов (мИЕ/мл),
Еф - экстинция протеиназы,
Еоп - экстинция опытного раствора,
V - объем инкубационной смеси,
VI - объем ферментного раствора (мл),
t - время протеолиза (мин).
Активность фермента выражали в ингибитор-ных единицах (ИЕ). В стандартных условиях за единицу ингибиторной активности принимали такое его количество, которое необходимо для
подавления единицы активности фермента на 100%.
РНК из растений выделяли фенольно-детер-гентным методом. Для получения кДНК на основе мРНК изученных образцов проводили реакцию обратной транскрипции с использованием M-MuLV-обратной транскриптазы ("Fermentas", Литва), согласно протоколу фирмы-поставщика. Концентрацию ДНК и РНК измеряли при А260/А280 на спектрофотометре Smart Spec™ Plus ("Bio-Rad", США), предварительно растворив образцы в Tris-EDTA-буфере. Полимеразно-цеп-ную реакцию (ОТ-ПЦР) проводили в амплифи-каторе ТП4-ПЦР-01-"Терцик" ("ДНК-технология", Россия). После амплификации фрагменты ДНК фракционировали методом электрофореза в 1-2%-ном агарозном геле или 7%-ном ПААГ в электрофоретической камере S2 ("НеИсоп", Россия). В качестве положительного контроля использовали ПЦР гена, кодирующего конститутивно экспрессирующийся тубулин. Прайме-ры к гену Triticum aestivum (bread wheat) oxalate oxidase precursor (AJ556991.1) F 5'-atg-act-tcc-tct-tct-cgt-cca-ag-3'; R 5 '-gga-gct-gaa-gag-tgt-caa-tgg-3' фланкируют участок гена оксалатоксидазы размером 410 пар нуклеотидов (п.н.). Праймеры к гену анионной пероксидазы T.aestivum F 5-ttc-gac-aag-cag-tac-tac-cac-aa-3'; R 5'-ccg-aag-tcc-gag-aag-aac-tg-3' подобраны на основе гена пшеницы (Peroxibase TC 151917), апмлификат размером 157 п.н. Праймеры к гену ингибиторов протеиназ (EU 293132.1) T.aestivum F 5'-ggg-ccc-tgc-aag-aag-tac-tg-3'; R 5'-aca-cgc-ata-ggc-acg-atg-ac-3', размер продукта 106 п.н. Праймеры к house-keeping гену ß-tubulin DQ 435668.1 :Tub. (F) 5'-cac-aca-gca-gat-gtg-gga-ct-3'; R 5 '-gtg-gag-ttg-cca-atg-aag-at-3' фланкируют участок размером 113 п.н.
Статистическую обработку результатов проводили с использованием компьютерных программ фирмы Stat Soft (Statistica 6.0), компьютерный анализ аминокислотных и нуклеотидных последовательностей - с помощью пакета компьютерных программ Lasergene ("DNASTAR, Inc.", США). Опыты проведены в 3-х биологических и 3-х химических повторностях. В работе приведены фотографии ПААГ после электрофореза с наилучшим разделением образцов. Количественные данные обрабатывали статистически, на рисунках приведены стандартные отклонения.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Возбудитель септориоза пшеницы Б. портит относится к паразитическим грибам с гемибио-трофным типом питания, т. е. свое развитие в
18-1 I 16-
1 14
2 12
I 10 i
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.