БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2007, том 24, № 3, с. 266-272
УДК 577.3722115
ВЛИЯНИЕ ХОЛЕСТЕРИНА НА ПОЛЯРНЫЕ ГРУППЫ ЛИПИДНОГО БИСЛОЯ: ИССЛЕДОВАНИЕ С ПОМОЩЬЮ ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО ЗОНДА 4-ДИМЕТИЛАМИНОХАЛКОНА
© 2007 г. В. Ю. Светличный, Г. Е. Добрецов, С. К. Гуларян, Ф. Мерола*,
Т. И. Сырейщикова**
Научно-исследовательский институт физико-химической медицины Федерального агентства
здравоохранения и социального развития РФ, 119992 Москва, ул. Малая Пироговская д. 1а; факс: (495) 246-47-71; электронная почта: info@ripcm.org.ru * Лаборатория химической физики, Университет Парижа 11, Орсэй, Франция ** Физический институт им. П.Н. Лебедева РАН, 119991 Москва, Ленинский пр-т, д. 53; факс(495) 135-78-80; электронная почта: postmaster@lebedev.ru
Поступила в редакцию 31.07.2006 г. После доработки 30.10.2006 г.
Параметры флуоресценции зонда 4-диметиламинохалкона (ДМХ) в бислойной мембране из яичного фосфатидилхолина чрезвычайно чувствительны к присутствию холестерина. Причина состоит в том, что холестерин влияет на свойства сольватной оболочки молекул ДМХ, образованной молекулами липида в мембране. Популяция молекул ДМХ в мембране гетерогенна и может быть представлена как две различающиеся популяции. Первая популяция включает около 60% молекул ДМХ. Эти молекулы флуоресцируют в области 485 нм с коротким временем затухания (0.3 нс), и присутствие 30 мол. % холестерина почти не влияет на свойства их сольватной оболочки. Вторая популяция молекул ДМХ отвечает более чем за половину всей излучаемой флуоресценции. Переориентация диполей сольватной оболочки этих молекул вызывает большой стоксов сдвиг спектра флуоресценции, который составляет 50 нм (от 485 до 535 нм) в отсутствие холестерина. Присутствие холестерина снижает влияние релаксационных процессов в этой оболочке на сдвиг спектра флуоресценции ДМХ, который при 30 мол. % холестерина составляет лишь 22 нм. Одновременно холестерин уменьшает процессы тушения флуоресценции второй популяции ДМХ, поскольку квантовый выход флуоресценции этих молекул возрастает в 2 раза. Переориентация диполей сольватной оболочки, вызывающая стоксов сдвиг, происходит менее чем за 0.1 нс. Возможно, этими быстро ре-лаксирующими диполями являются молекулы воды, проникающие в бислой. Полученные результаты показывают, что холестерин изменяет не весь бислой, так что в мембране остаются области, не затронутые влиянием холестерина, даже когда число его молекул достигает трети от общего ли-пида.
Флуоресцентные зонды используются как чувствительные индикаторы изменений структуры липидной фазы мембран и липопротеинов. Одним из наиболее чувствительных является незаряженный зонд 4-диметиламинохалкон (ДМХ), предложенный в 1972 г. [1] (рис. 1): при изменении окружения ДМХ спектр его флуоресценции может сдвигаться более чем на 100 нм, а интенсивность флуоресценции - изменяться в 1000 раз [2-4].
Позже появились и другие флуоресцентные зонды со сходными свойствами: PRODAN [5], LAURDAN [6], нильский красный [7] и др., которые до настоящего времени применяются для изучения биологических и модельных мембран (см. [8-10]). Роль таких зондов особенно возрастает при изучении структуры реальных мембран в жи-
вой клетке [11, 12], где большинство других физических методов уже не может быть использовано.
Вместе с тем возможности применения таких зондов в качестве физического инструмента ограничены тем, что по изменениям флуоресценции трудно точно описать характер тех событий в структуре мембран, которые повлияли на флуоресценцию: ведь флуоресценция зонда зависит от множества факторов. Поэтому вопрос о точной физической интерпретации данных, получаемых с помощью флуоресцентных зондов, остается по-прежнему очень важным.
В этом отношении ДМХ является сегодня одним из наиболее исследованных флуоресцентных зондов, особенно в результате работ, проведенных в последние годы [2-4, 13, 14]. При возбуждении
молекулы ДМХ ее дипольный момент возрастает [2, 14], и если рядом с зондом находятся подвижные полярные молекулы, то начинается их переориентация. За время жизни возбужденного состояния ДМХ эта переориентация отнимает часть энергии зонда, и чем сильнее такое взаимодействие, тем более длинноволновым будет спектр флуоресценции. Наблюдение за кинетикой сдвига спектра флуоресценции зонда позволяет судить о количестве и подвижности полярных молекул, окружающих зонд. Для интерпретации изменений флуоресценции зонда в мембранах нами недавно был разработан специальный алгоритм анализа кинетики стоксова сдвига спектра ДМХ в липидном бислое [13]. Было показано, что в модельной мембране из фосфатидилхолина есть две различные популяции молекул зонда. Эти популяции различаются количеством и (или) подвижностью окружающих зонд диполей. В каждой из популяций сразу после возбуждения происходит быстрый (не более одной пикосекунды) сдвиг спектра флуоресценции примерно на 55-60 нм [4], обусловленный перестройками в самой молекуле ДМХ и ее электронно-поляризационным взаимодействием с молекулами окружения. Этот сдвиг одинаков у обеих популяций зонда в мембране. Однако дальше события развиваются по-разному. Спектр флуоресценции молекул первой популяции, имеющих время жизни возбужденного состояния около 0.3 нс, в дальнейшем не изменяется во времени (табл. 1). По-видимому, в их ближайшем окружении нет (или мало) полярных молекул, способных к релаксации. Вместе с тем около второй популяции ДМХ, время жизни возбужденного состояния которой около 0.7 нс, происходит переориентация полярных молекул: спектр флуоресценции этой популяции сдвигается дополнительно на 50 нм (табл. 1). Вероятно, этот сдвиг происходит очень быстро (менее чем за 0.1 нс) [13]. Едва ли в окружении зонда полярные группы молекул фосфолипида способны переориентироваться так быстро; вероятно, этими быстро релаксирующими диполями являются молекулы воды, проникающие в мембрану.
<рНз NCH3
O
Рис. 1. Молекула флуоресцентного зонда 4-диметил-аминохалкона (ДМХ).
Как изменяется динамическая структура фос-фолипидной мембраны в присутствии холестерина? Этот вопрос уже давно исследуется, и интерес к нему не пропадает [15-18]. Для изучения влияния холестерина на свойства бислоя в настоящей работе была исследована динамика процессов, происходящих в окружении возбужденной молекулы ДМХ с временным разрешением около 0.1 нс. Для анализа этих данных использован алгоритм, описанный ранее [13] и получивший дальнейшее развитие.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В работе использовали яичный фосфатидилхо-лин и холестерин производства фирмы "Aldrich" (США).
ДМХ был синтезирован и любезно предоставлен Б.М. Красовицким (Институт монокристаллов НАН Украины, г. Харьков).
Липосомы получали быстрым впрыскиванием этанольного раствора яичного лецитина и холестерина в большой объем буферного раствора 0.15 М NaCl, 0.01 М трис-HCl, рН 7.4. Все спектральные измерения проведены при концентрации липида 0.1 мг/мл и концентрации ДМХ 3.3 мкМ при 20°С.
Стационарные спектры флуоресценции измерены на спектрофлуориметрах Spex Fluorolog 1681 (США) и Hitachi F-4000 (Япония).
Затухание флуоресценции при длинах волн 460, 500, 540 и 580 нм измеряли в лаборатории по использованию электромагнитного излучения (LURE) университета Орсэй (Франция); детали
Таблица 1. Параметры, характеризующие две популяции молекул ДМХ в мембранах из яичного фосфатидилхолина с различным содержанием холестерина
Параметр Популяция I Популяция II Популяция I Популяция II
0 мол. % холестерина 30 мол. % холестерина
Максимум спектра стационарной флуоресценции, нм 485 ± 4 535 ± 5 485 ± 3 507 ± 5
Стоксов сдвиг спектра флуоресценции, нм 60 ± 4 113 ± 5 60 ± 3 85 ± 5
Молярная доля популяции среди всех молекул ДМХ, % 57 ± 7 43 ± 7 65 ± 5 35 ± 5
Доля флуоресценции, % от всех излученных квантов 45 ± 6 55 ± 6 32 ± 5 68 ± 5
Время затухания флуоресценции т, нс 0.31 ± 0.04 0.68 ± 0.06 0.31 ± 0.04 1.3 ± 0.1
Квантовый выход флуоресценции Q 0.08 ± 0.01 0.13 ± 0.01 0.08 ± 0.01 0.29 ± 0.02
Интенсивность
Рис. 2. Нормированные спектры стационарной флуоресценции ДМХ в суспензии липосом из яичного фос-фатидилхолина с различным содержанием холестерина. Цифры около кривых - молярная доля холестерина в смеси двух липидов.
описаны ранее [13]. Возбуждение проводилось при длине волны 420 нм и длительности импульса около 0.6 нс (на уровне половины высоты светового импульса). Деконволюция кривых затухания проведена согласно общепринятой процедуре [13, 19]. Квантовый выход флуоресценции каждой из популяций ДМХ рассчитывали по величине констант скоростей излучательной и безызлучательной дезактивации, как описано ранее [13].
Принципы расчета кинетики сдвига спектра флуоресценции ДМХ в мембране подробно описаны в предыдущей статье [13]. Для проверки адек-
^тах, нм Полуширина спектра, нм
Рис. 3. Положение максимума (1) и полуширина (2) спектра стационарной флуоресценции ДМХ в липосо-мах из яичного фосфатидилхолина в зависимости от содержания холестерина.
ватности описания экспериментальных данных с помощью моделей использовали следующий подход. Сначала рассчитывали кинетику затухания флуоресценции, предсказываемую моделью. Затем имитировали реальное затухание: свертывали эту кинетику с аппаратной функцией, описывающей импульс возбуждающего света, и накладывали пуассоновский шум. Затем пытались провести деконволюцию (как и в случае реально измеренного затухания), полагая, что кинетика может быть представлена в виде суммы спадающх экспонент и подбирая параметры этих экспонент так, чтобы достигалась минимальная величина критерия %2 расхождений между имитированной кинетикой и этой суммой экспонент [19, 20].
РЕЗУЛЬТАТЫ
В бислойной мембране из яичного фосфатидилхолина спектр стационарной флуоресценции ДМХ намного шире, чем в органических растворителях. Это обусловлено описанной выше гетерогенностью: спектр является суммой спектров от двух популяций ДМХ с максимумами флуоресценции 485 и 535 нм [13]. Этот широкий спектр (ширина на половине высоты равна 105 нм) можно видеть на рис. 2, а параметры двух упомянутых компонент спектра флуоресценции, рассчитанные согласно описанному ранее алгоритму [
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.