БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2014, том 31, № 3, с. 204-217
УДК 581.1:581.19
ВЛИЯНИЕ ХОЛОДОВОГО ШОКА НА ЖИРНОКИСЛОТНЫЙ СОСТАВ И ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ МИТОХОНДРИЙ ЗАКАЛЕННЫХ И НЕЗАКАЛЕННЫХ ПРОРОСТКОВ ОЗИМОЙ ПШЕНИЦЫ
© 2014 г. О. И. Грабельных1, 2, К. А. Кириченко1, Т. П. Побежимова1, О. А. Боровик1, Н. С. Павловская1, 2, И. В. Любушкина1, 2, Н. А. Королева1, В. К. Войников1
1Сибирский институт физиологии и биохимии растений Сибирского отделения РАН, 664033, Иркутск, а/я 317;
электронная почта:grolga@sifibr.irk.ru 2Иркутский государственный университет, 664003, Иркутск, ул. Сухэ-Батора, 5 Поступила в редакцию 15.08.2013 г.
Проведен анализ жирнокислотного состава митохондрий и их функционального состояния. Определено содержание активных форм кислорода (АФК) и продуктов перекисного окисления липидов, а также окислительной и фосфорилирующей активности, проницаемости наружной мембраны для экзогенного цитохрома с, содержания дегидринов, альтернативной оксидазы (АО) и разобщающих белков (иСР) в незакаленных и закаленных при 2°С в течение 7 сут (1 этап) и 2°С в течение 7 сут и —2°С в течение 2 сут (2 этапа) проростках озимой пшеницы ТпНсит aestivum Ь. после действия на проростки отрицательной температуры —8°С (6 ч). Показано, что холодовое закаливание эффективно повышает морозоустойчивость проростков и сопровождается синтезом дегидринов в побегах и в изолированных из них митохондриях. Установлено, что функциональная активность митохондрий при холодовом шоке зависит от содержания АФК и определяется составом жирных кислот, среди которых важную роль для сохранения активности митохондрий играет а-линоленовая кислота. Выявлено, что на первом этапе холодового закаливания в митохондриях повышается содержание АО и иСР1/2, которые, вероятно, участвуют в поддержании необходимого про/антиоксидант-ного статуса клеток. Обсуждается важная роль а-линоленовой кислоты, дегидринов, АО и ИСР в механизмах холодо- и морозоустойчивости растений, связанная с сохранением целостности мито-хондриальных мембран и функциональной активности органелл.
Ключевые слова: митохондрии, жирнокислотный состав митохондрий, активные формы кислорода, альтернативная оксидаза, разобщающие белки, дегидрины, холодовой шок, холодовое закаливание, озимая пшеница.
Б01: 10.7868/80233475514020029
Низкие температуры являются одним из важных факторов окружающей среды, ограничивающих продуктивность и распространение растений. Мембранные системы клетки одними из первых реагируют на понижение температуры, а сенсорным компонентом мембран, по-видимому, служат липиды, от состава и соотношения которых зависит текучесть (и вязкость) мембран, определяющая структуру и функции мембранных белков и, таким образом, активность мембрано-связанных процессов [1]. Важность сохранения процесса окислительного фосфорилирования, протекающего во внутренней мембране митохондрий, при действии на растения низких температур не вызывает сомнений. Изменения состава жирных кислот (ЖК) митохондрий растений при низких температурах изучают довольно давно, однако однозначный ответ на вопрос о том, какие
изменения жирнокислотного состава считать адаптивными, не получен. Одни авторы считают, что сдвиг в сторону большей ненасыщенности, в основном вызванной повышенным содержанием а-линоленовой кислоты, может определять устойчивость растений к холоду и морозу [2—5]. Согласно позиции других авторов, повышение ненасыщенных ЖК (ННЖК) в липидах митохондрий представляет собой неспецифическую реакцию и не связано с криозакаливанием [6]. Кроме того, существует мнение, что обогащение мембран митохондрий полиненасыщенными ЖК нежелательно, поскольку в таких мембранах возникает риск развития процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) [7]. ПОЛ можно рассматривать как механизм регуляции активности мембраносвязанных ферментов [8]. Инициировать ПОЛ способны активные формы кислоро-
да (АФК), что может приводить к нарушению свойств и функций клеточных мембран [9, 10].
Митохондрии являются как мишенью, так и и одним из основных источников образования АФК в нефотосинтезирующих клетках растений [10—13]. При этом комплексы I и III дыхательной цепи являются основными сайтами генерации супероксидного радикала [11, 12]. Значительное накопление супероксид-радикала приводит к образованию пероксида водорода [14], скорость образования которого зависит от мембранного потенциала и степени восстановленности компонентов электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) [11]. В физиологических условиях наблюдается равновесие между продукцией АФК митохондриями и их детоксика-цией, обусловленной действием защитных ферментов и низкомолекулярных антиоксидантов [10—13]. Функционирование альтернативной цианидрези-стентной оксидазы (АО) и разобщающих белков (иСР) предотвращает сверхвосстановление ЭТЦ и образование супероксид-радикала в митохондриях растений [15—19]. Действие низких температур может приводить к развитию окислительного стресса у растений, связанного с увеличением содержания АФК и продуктов ПОЛ [20, 21]. Митохондрии холодочувствительных растений служат источником генерации супероксид-радикала при низкой температуре [22]. Активацию энергорас-сеивающих систем в митохондриях холодоустойчивых растений при низких температурах, по-видимому, можно рассматривать как защитный механизм, предотвращающий образование АФК при последующем действии неблагоприятных, в том числе, отрицательных температур [23, 24].
Синтез стрессовых белков — важный компонент механизма низкотемпературной адаптации у растений [25]. Среди белков низкотемпературного стресса дегидрины представляют собой самое известное семейство [26]. Дегидрины, обнаруженные в различных компартментах растительной клетки, включая митохондрии [27], обладают криопротекторной, антифризной и антиокси-дантной активностью, защищают липиды мембран от ПОЛ [26]. При холодовом закаливании проростков озимой пшеницы содержание дегид-ринов в кристах митохондрий увеличивается в 3 раза [28], что указывает на важную роль этих белков в защите ЭТЦ митохондрий при холодовом воздействии. Несмотря на достижения последних лет [25], связь между содержанием АФК, жирнокислотным составом и функциональной активностью митохондрий, а также между содержанием дегидринов и белков, предотвращающих образование АФК в ЭТЦ митохондрий, в условиях низких температур до конца не изучена. Особенно важно понять такую связь в случае ценных в хозяйственном отношении озимых злаков.
В представленной работе проведен сравнительный анализ жирнокислотного состава и функциональной активности митохондрий незакаленных и закаленных проростков озимой пшеницы при холодовом шоке и зависимости изменений этих параметров от содержания в митохондриях АФК и некоторых стрессовых белков.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Работа проведена на митохондриях, выделенных из проростков озимой пшеницы (Triticum aestivum L., сорт Иркутская), выращенных в стандартных условиях и после низкотемпературной обработки.
Проращивание семян пшеницы. Семена промывали мыльным раствором и замачивали на 20 мин в 0.01% растворе KMnO4. Затем семена тщательно отмывали и проращивали в течение 3 сут на влажной фильтровальной бумаге при 25°С (Контроль). Кювету с проростками переносили в холодильную камеру (2°С, 7 сут) для прохождения первой фазы холодового закаливания (Хол. зак. 1 этап), а затем в инкубатор (2 сут при —2°С) для прохождения второй фазы холодового закаливания (Хол. зак. 2 этапа).
Определение морозоустойчивости проростков.
Морозоустойчивость контрольных и закаленных проростков озимой пшеницы определяли по их отрастанию после воздействия отрицательной температуры (—8°С) в течение 0—6 ч. Учет выживших проростков проводили через 7 сут после хо-лодового шока.
Митохондрии выделяли из побегов проростков с помощью дифференциального центрифугирования с последующей очисткой в градиенте плотности перколла 23 и 35% (v/v), по методике, опубликованной ранее [23]. Интактность внешней мембраны митохондрий рассчитывали по скорости аскорбат-зависимого стимулируемого цито-хромом с KCN-чувствительного поглощения кислорода [29] в отсутствие и в присутствии 0.04% Тритона Х-100.
Скорости дыхания митохондрий определяли при помощи кислородного электрода Кларка и полярографа ОН-105 (Венгрия) при 26°С. Реакционная среда содержала 300 мМ сахарозы, 20 мМ MOPS (рН 7.4), 5 мМ Mgd2, 10 мМ EDTA и 0.1% бычьего сывороточного альбумина (БСА), свободного от жирных кислот. В качестве субстрата окисления использовали 8 мМ сукцинат в присутствии 5 мМ глутамата и 3 мкМ ротенона (ингибитор комплекса I ЭТЦ). Для активации сукцинатдегидрогеназы применяли 200 мкМ АТР. Максимальную скорость окисления сукцината измеряли в присутствии 100 мкМ АDP. Концентрацию митохондриального белка определяли по методу [30]. Скорости дыхания митохондрий и
параметры сопряжения окисления с фосфорили-рованием рассчитывали согласно [31, 32]: V3 — скорость окисления субстрата в присутствии ADP (состояние 3 или скорость дыхания в фосфорили-рующем состоянии), V4 — скорость окисления субстрата после истощения ADP (состояние 4 или скорость дыхания в нефосфорилирующем состоянии), КДК — коэффициент дыхательного контроля по Чансу и Вильямсу (КДК = V3/V4), ADP/О — отношение молей фосфорилированно-го ADP к количеству атомов поглощенного кислорода.
Получение и анализ метиловых эфиров жирных кислот. Суспензию митохондрий (~5—10 мг белка/мл) фиксировали жидким азотом и растирали в фарфоровой ступке до получения гомогенной массы. Липиды экстрагировали смесью хлороформ : метанол (2 : 1) [33]. Хлороформ из липид-ного экстракта удаляли под вакуумом с помощью роторного испарителя ИР-1ЛТ (Labtex, Россия). Липиды из мембран митохондрий экстрагировали по модифицированному методу Фолча [34]. Метиловые эфиры ЖК (МЭЖК) получали кислотным метанолизом (с помощью 1% метаноль-ного раствора H2SO4) суммарной фракции липидов митохондрий. МЭЖК после охлаждения трижды экстрагировали гексаном [34]. МЭЖК дополнительно очищали методом тонкослойной хроматографии на алюминиевых пластинах с си-ликагелем Sorbfil ПТСХ-АФ-В (Россия) в камере с бензолом. Анализ МЭЖК проводили методом
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.