научная статья по теме ВЛИЯНИЕ IDO1 НА ДЕЦИДУАЛИЗАЦИЮ У МЫШЕЙ Биология

Текст научной статьи на тему «ВЛИЯНИЕ IDO1 НА ДЕЦИДУАЛИЗАЦИЮ У МЫШЕЙ»

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2015, том 49, № 4, с. 649-657

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ

УДК 57.053;577.151.05

ВЛИЯНИЕ Idol НА ДЕЦИДУАЛИЗАЦИЮ У МЫШЕЙ

© 2015 г. D.-D. Ш, Y.-H. Yin2% J.-Y. Wu3, Z.-Q. Yang1, H. Cao1, Q.-L. Zhang1, B. Guo1*, Z.-P. Yue1

1College of Veterinary Medicine, Jilin University, Changchun, P. R. China 2Guizhou Minzu University, Guiyang, P. R. China 3Department of Laboratory Medicine, General Hospital of Jinan Military Region of PLA, Jinan, P. R. China

Поступила в редакцию 07.08.2014 г.

Принята в печать 28.10.2014 г.

Индолеамин-2,3-диоксигеназа 1 (indoleamine 2,3-dioxygenase 1 — Ido1) — это скоростьлимитирующий фермент, который конвертирует незаменимую аминокислоту триптофан в кинуренин. Цель этого исследования состояла в исследовании экспрессии и регуляции экспрессии Ido1 в матке мышей в процессе де-цидуализации. Показано, что уровень мРНК Ido1 постепенно увеличивается в течение первых четырех суток беременности, достигая пика на 4-е сут. На 5-8-е сут беременности уровень экспрессии Ido1 в матке был низким. Одновременно с этим наблюдали низкие уровни экспрессия мРНК Ido1 как в деци-дуализованной матке, так и в клетках стромы, обработанных 8-Вг-аденозин-3',5'-цикломонофосфатом (8-Br-cAMP). При децидуализации in vitro экспрессия мРНК Ido1 постепенно снижалась. Выявлено, что в условиях децидуализации in vitro сверхэкспрессия Ido1 ингибирует экспрессию генов-маркеров децидуализации — PRL, IGFBP1 и Dtprp, — тогда как ингибирование Ido1 под действием L-1-MT индуцирует экспрессию этих генов. В условиях децидуализации in vitro Ido1 предотвращает пролиферацию стромальных клеток матки и усиливает экспрессию гена Bax, при этом соотношение экспрессии Bax/Bcl2 увеличивается. Кроме того Ido1 модулирует экспрессию гена MMP2. В стромальных клетках матки экспрессию Idol стимулируют эстроген и прогестерон. На основании этих результатов можно предположить, что Ido1 играет важную роль в процессе децидуализации и регулируется эстрогеном и прогестероном в стромальных клетках матки.

Ключевые слова: Ido1, децидуализация, матка, мышь.

EFFECTS OF Ido1 ON MOUSE DECIDUALIZATION, by D.-D. Li1, Y.-H. Yin2, J.-Y. Wu3, Z.-Q. Yang1, H. Cao1, Q.-L. Zhang1, B. Guo1*, Z.-P. Yue1 (1College of Veterinary Medicine, Jilin University, Changchun, P. R. China, *e-mail: guobin79@jlu.edu.cn; 2Guizhou Minzu University, Guiyang, P. R. China; 3Department of Laboratory Medicine, General Hospital of Jinan Military Region of PLA, Jinan, P. R. China). Indoleamine 2,3-dioxygenase 1 (Ido1) is a rate-limiting enzyme which converts the essential amino acid tryptophan to kynurenine. The aim of this study was to investigate the expression and regulation of Ido1 in mouse uterus during decidualization. The results showed that Ido1 mRNA expression gradually increased from day 1 to 4 of pregnancy and reached the peak level on day 4. On days 5—8 of pregnancy, a low level of Ido1 expression was observed in the uteri. Simultaneously, Ido1 mRNA was also lowly expressed in the decidualized uterus and the stromal cells treated with 8-Br-cAMP. Under in vitro decidualization, the expression of Ido1 mRNA gradually declined. Further studies found that overexpression of Ido1 can inhibit the expression of decidualization marker genes PRL, IGFBP1 and Dtprp under in vitro decidualization while inhibition of Ido1 with L-1-MT can induce the expression of these marker genes. Ido1 can prevent uterine stromal cells proliferation and enhance the expression of the Bax gene and increase the Bax/Bcl2 ratio under in vitro decidualization. Additionally, Ido1 can also modulate the expression of the MMP2 gene. In the uterine stromal cells, estrogen and progesterone can stimulate the expression of Ido1. These data indicate that Ido1 may play an important role during mouse decid-ualization and may be regulated by estrogen and progesterone in the uterine stromal cells.

Keywords: Ido1, decidualization, uterus, mouse. DOI: 10.7868/S002689841503012X

# Текст представлен авторами на английском языке. f Вклад этих авторов одинаков.

* Эл. почта: guobin79@jlu.edu.cn

Децидуализация — процесс, в ходе которого стромальные клетки матки подвергаются активной пролиферации и последующей дифференци-ровке в полиплоидные децидуальные клетки, — критичная стадия для формирования плаценты и сохранения беременности [1, 2]. Нарушения в децидуализации могут привести к смерти плода, самопроизвольному аборту и таким патологиям, как преэклампсия (поздний токсикоз беременных) или задержка внутриутробного развития [3]. Несмотря на то, что уже идентифицировано множество генов, связанных с децидуализацией, молекулярный механизм, лежащий в основе этого процесса, остается пока неизвестным.

Индоламин-2,3-диоксигеназа 1 (Idol) — внутриклеточный фермент, который у млекопитающих катализирует инициирующую и скорость-ли-митирующую стадию метаболизма незаменимой аминокислоты триптофан по кинурениновому пути [4—8]. Традиционно считалось, что Idol выполняет функцию иммуномодулятора, снижающего доступность триптофана [6—8]. Сверхэкспрессия Idol оказывает сильное иммуносупрессивное действие [9]. Введение ингибитора Idol — 1-метил-L-триптофана (L-1-MT) — беременным мышам с аллогенными трансплантатами оплодотворенных яйцеклеток, может приводить к отторжению всех зародышей и к неспособности этих мышей к благополучной беременности, в то время как у мышей с сингенными оплодотворенными яйцеклетками эмбриональных потерь не происходило [10, 11]. Одновременно Ido1 находят в придатке яичка, влагалище, шейке, маточных трубах, матке и плаценте [12—14]. В эндометрии человека Ido1 выявлен в железистых, поверхностных эпителиальных и стромальных клетках и показано его модулирующее действие на пролиферацию и апоптоз стромальных клеток эндометрия [8, 12]. При индуцированной прогестероном децидуа-лиации стромальных клеток эндометрия человека экспрессия Idol подавлена [15]. Более того, аберрантная экспрессия Idol выявлена у женщин с эндометриозом [14]. Idol также экспрессируется в железистых и люминальных эпителиальных клетках матки, гигантских трофобластах мышей и во вневорсинчатых и ворсинчатых трофобластах человека [16, 17]. На основании этих данных можно считать, что фермент Ido1 важен для нормальной репродуктивности самок. Тем не менее механизмы экспрессии, регуляции и функционирования Ido1 в матке мыши при децидуализации до сих пор неизвестны.

Цель этого исследования состояла в том, чтобы исследовать экспрессию и регуляцию экспрессии Idol в матке мышей во время децидуали-зации.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Лабораторные животные. Взрослых мышей (линия Kunming White) содержали в клетках в условиях микроклимита со световым циклом 14L : 10D. Все проводимые с животными процедуры получили одобрение Комитета по содержанию и использованию лабораторных животных Цзилиньского университета (The Institutional Animal Care and Use Committee ofJilin University, Китай). Воспроизводимость результатов подтверждали использованием не менее трех мышей в группе на каждой стадии исследования или обработки.

Беременность и псевдобеременность. Взрослых самок мышей подсаживали к фертильным или ва-зэктомированным самцам той же линии с целью индуцировать соответственно беременность или псевдобеременность (за первые сут беременности принимали день обнаружения у самки копуля-тивной пробки). На 1-4-е сут беременность подтверждали по движению эмбриона в маточных трубах или матке. На 5-е сут сайты прикрепления эмбриона идентифицировали внутривенным введением 0.1 мл 1%-ого раствора Чикаго синего ("Sigma", США) в 0.85%-ом растворе NaCl.

Искусственно индуцированная децидуализация. Искусственную децидуализацию индуцировали интралюминальной инфузией кунжутного масла (25 мкл) в один маточный рожок на 4-е сут псевдобеременности, в то время как контралатераль-ный неинъецированный рожок служил контролем. Матки собирали на 8-е сут псевдобеременности. Децидуализацию подтверждали путем взвешивания маточного рожка и гистологическим анализом маточных срезов.

Выделение стромальных клеток матки и децидуализация in vitro. Клетки стромы матки выделяли на 4-е сут беременности и культивировали, как описано ранее [18]. В стромальных клетках матки индуцировали децидуализацию in vitro, используя свежеприготовленную среду, содержащую прогестерон (1 мкМ) и эстроген (10 нМ) в DMEM/F12 с 2% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (FBS), обработанной углем ("Biological Industries Ltd.", Израиль). Кроме того, стромальные клетки матки обрабатывали аналогом циклического AMP - 8-Br-cAMP (500 мкМ).

Обработка стероидными гормональными препаратами in vitro. Культивируемые стромальные клетки обрабатывали прогестероном (100 нМ) или эстрогеном (0.1 нМ) и собирали через 0, 1, 3, 6, 12 и 24 ч для последующего количественного анализа методом ПЦР в реальном времени. Все стероиды растворяли в этаноле. В качестве контроля использовали клетки, обработанные только растворителем.

Конструирование плазмид и трансфекция. Фрагмент кДНК Idol из матки мыши амплифи-цировали с помощью ПЦР, используя следую-

щие праймеры: 5'-GATATCATGGCACTCAG-TAAAATATCTCC-3' и 5'-CTCGAGCTAAGGCC-AACTCAGAAGAGC-3', — с сайтами расщепления для EcoRV и XhoI (подчеркнуты). Амплифи-цированный продукт очищали и клонировали в вектор pGEM-T. Как pGEM-T-Idol, так и вектор pcDNA3.1 вырезали рестриктазами EcoRV/XhoI ("TaKaRa", Китай) при 37°C в течение 1 ч. Полученный фрагмент лигировали в pcDNA3.1 с помощью Т4-лигазы ("Promega") при 4°C в течение ночи для создания конструкта pcDNA-Idol (pc-Idol). Пустой экспрессионный вектор pcDNA3.1 использовали в качестве контроля.

Трансфекцию стромальных клеток матки проводили согласно рекомендациям производителя для Lipofectamine-2000 ("Invitrogen"). После трансфекции контрольной плазмидой (пустой вектор pcDNA3.1) или pc-Idol стромальные клетки мышей — на 4-е сут беременности — собирали или индуцировали децидуализацию in vitro в течение 48 ч.

ОТ-ПЦР в реальном времени. Суммарную РНК матки мыши или культивируемых клеток выделяли с помощью реагента TRIPURE по методике производителя ("Roche") и, испол

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Биология»