ИЗВЕСТИЯ РАИ. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2007, № 6, с. 645-649
БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ
УДК 577.352.336
ВЛИЯНИЕ ИХФАНОВ НА СТРУКТУРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ МЕМБРАНЫ ЭРИТРОЦИТОВ
© 2007 г. Е. Ю. Паршина*, Л. Я. Гендель**, А. Б. Рубин*
*Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, 119899 Москва,
Ленинские горы
**Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, 117977 Москва, ул. Косыгина, 4
E-mail: parshinae@yandex.ru Поступила в редакцию 16.05.2006 г.
Методами сканирующей электронной микроскопии и спиновых зондов выявлены морфологические трансформации эритроцитов и структурные изменения эритроцитарной мембраны, индуцированные встраиванием в мембрану и распределением во внутримембранном пространстве ихфанов -препаратов нового поколения, обладающих комбинированным антиоксидантным и антихолинэсте-разным действием. Показаны различия в распределении и эффективности модифицирующего действия различных по гидрофобным свойствам производных. Определено, что производные, содержащие в алифатической цепи бокового заместителя 8 и 10 углеродных атомов являются наиболее эффективными модификаторами структуры эритроцитарной мембраны и морфологии эритроцитов.
Актуальной задачей физико-химической биологии и фармакологии является поиск новых эффективных лекарственных препаратов. Одно из направлений поиска - создание препаратов комбинированного действия, т. е. соединений,содержащих в своей структуре фрагменты, обладающие различными видами биологической активности. Таковыми являются синтезированные в Институте биохимической физики (ИБХФ) РАН гибридные антиоксиданты - ихфаны (Никифоров и др., 2003). В их структуру включены два фрагмента, обеспечивающие антиоксидантную и антихолинэстеразную активности, кроме этого они имеют боковой алкильный заместитель с различным содержанием углеродных атомов в алифатической цепи, обусловливающий гидрофобные свойства производных этого ряда. Химический дизайн ихфанов, по мнению ряда авторов, позволяет рассматривать их в качестве перспективных препаратов для лечения болезни Альц-геймера (Bragmskaya et а!., 1996; Molotchkina в1 а!., 2002).
Выявлены высокая антиоксидантная активность ихфанов и их ингибирующее действие на ацетилхолинэстеразу эритроцитов человека, а также различия в эффективности действия разных по гидрофобным свойствам производных (Braginskaya et а1., 1996; Озерова, 2000; Molotchki-ш et а!., 2002; Никифоров и др., 2003).
Известно, что функциональная активность эритроцитов во многом определяется их формой и ее изменениями под влиянием биологически активных препаратов, при развитии патологиче-
ских процессов в организме и действии других факторов (Sheetz, Singer, 1974; Гендель, Кругля-кова, 1986; Лунева и др., 2002). Изменения формы эритроцитов, индуцируемые мембранным транспортом отдельных представителей ряда ихфанов выявлены в работе Паршиной с соавт. (2004).
До настоящего времени не было изучено влияние производных ряда ихфанов непосредственно на структуру плазматической мембраны эритроцитов.
В связи с этим в данной работе было продолжено исследование методом сканирующей электронной микроскопии влияния различных по гидрофобным свойствам производных ряда ихфанов на морфологию эритроцитов и с использованием метода спиновых зондов изучены их воздействия на структуру эритроцитарной мембраны.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали синтезированные в ИБХФ РАН производные группы ихфанов (Никифоров и др., 2003), содержащие различные алифатические заместители у четвертичного атома азота (таблица).
Объектом исследований служили эритроциты из крови белых беспородных крыс (в качестве антикоагулянта использовали гепарин). Эритроциты выделяли по методике, описанной Луневой и соавт. (2002). В опытах использовали эритроциты, суспендированные в буфере (145 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 4 мМ NajHPO^ 1 мМ NaH2PO4, 1 мМ MgSO4, 1 мМ CaCl2, 10 мМ глюкозы, рН 7.4,
Структурные формулы и условные обозначения производных ряда ихфанов
Структурная формула X R Ихфан
НзС CH3 OH CH3 J-Br- -CH3 -C8H17 И^-1) И^-Б)
ИзС -C10H21 И^-Ш)
CH3 l + 3 —N+—RX 1 CH3 -C12H25 И^-12)
1 CH2CH2COOCH2CH2- -C16H33 И^-16)
Примечание. R - углеводородный радикал, X - анион галогена.
t = 4°C). Содержание клеток в суспензии составляло 1 х 107 кл./мкл. Полученную эритроцитар-ную массу хранили при 4°C и использовали в течение 8 ч.
При изучении влияния ихфанов на морфологию эритроцитов проводили инкубацию клеток с каждым из производных в течение различных интервалов времени (от 2 до 120 мин) при температуре 18 ± 2°С. Ихфаны использовали в виде растворов в этаноле, концентрация которого в образцах не превышала 0.8 об. %. Контролем служили образцы, инкубировавшиеся в идентичных условиях, но без добавки испытуемого соединения.
Фиксацию образцов в 1%-ном растворе глюта-рового альдегида (SERVA, Германия) в буфере проводили в течение 3 ч, затем производили отмывку клеток в соответствии с имеющимися в литературе рекомендациями (Козинец, Симоварт, 1984).
Клетки наносили в один слой на покровное стекло, высушивали на воздухе и напыляли слоем платины с палладием в вакуумной напыли-тельной установке EICO IB-3. В работе использовали сканирующий электронный микроскоп CAMSCAN (Великобритания).
Изучение влияния ихфанов на структуру эрит-роцитарной мембраны проводили методом спиновых зондов, в качестве которых использовали 5- и 16-доксилстеараты, в дальнейшем обозначенные как зонды I и II соответственно.
Зонды вводили в суспензии эритроцитов в виде растворов в этаноле, конечная концентрация зонда составляла 1 х 10-4 М. После инкубации с зондом в течение 7 мин в суспензию эритроцитов добавляли исследуемое вещество и сразу готовили образцы для регистрации спектров электронного парамагнитного резонанса (ЭПР). Суммарное содержание этанола в образцах не превышало 1.2 об. %. Контролем служили образцы, инкубировавшиеся в идентичных условиях, но в отсутствие испытуемого препарата.
В качестве структурно-чувствительных параметров определяли расстояние (в Гс) между экстремумами спектра ЭПР зонда I в области низких
и высоких полей 2 A'| и время корреляции т, равное времени поворота на 90° зонда II (Анциферова и др., 1977). Значения т оценивали с использованием формулы:
т = 6.65АЯ+1 (10-10с,
где 1+1 и 1_1 - амплитуды соответственно низкополевой и высокополевой компонент спектра ЭПР, АН+1 - ширина низкополевой компоненты спектра, Гс.
В работе использовали радиоспектрометр РЭ-1307. Инкубацию образцов и регистрацию спектров ЭПР проводили при температуре 18 ± 2°С.
Статистическую обработку результатов проводили с использованием критерия Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В таблице приведены структурные формулы использованных в работе производных ряда ихфанов. В левой части структуры производных находится фрагмент, представленный экранированным фенолом, обеспечивающий их антиокси-дантные свойства, справа содержится фрагмент, обусловливающий антихолинэстеразную активность соединений, и там же расположен связанный с четвертичным атомом азота алкильный заместитель, содержащий в алифатической цепи от 1-го до 16-ти атомов углерода. Чем длиннее алифатическая цепь заместителя, тем более гидрофобным является производное. Наличие в структуре ихфанов четвертичного атома азота придает им положительный заряд и свойства органических катионов.
Известно, что в норме основная масса эритроцитов крови млекопитающих имеет форму диско-цитов, иные морфологические формы (эхиноци-ты, стоматоциты и др.) присутствуют в малых ко-
%
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10
Контроль 0 20 40 60 80 100 120
1 • 2
A3 v4 о 5 е6
Контроль 0 20 40 60 80 100 120 Время, мин
Контроль 0 20 40 60 80 100 120
Рис. 1. Кинетические зависимости изменения содержания (%) и электронные микрофотографии (ув. х 1000) дискоцитов (а), эхиноцитов (б) и стоматоцитов (в) в суспензии эритроцитов под влиянием ихфанов (1 х 10-4 М) с различными по длине алифатической цепи гидрофобными заместителями. 1 - контроль, 2 - И(С-1), 3 - И(С-8), 4 - И(С-10), 5 - И(С-12), 6 - И(С-16).
личествах (Ве881з, 1974; Козинец, Симоварт, 1984). На рис. 1 приведены типичные кинетические кривые, отражающие изменения содержания дискоцитов, эхиноцитов и стоматоцитов в суспензии эритроцитов при добавлении в среду инкубации производных ряда ихфанов в концентрации 1 х 10-4 М.
Видно, что инкубация суспензии эритроцитов с ихфанами приводила к изменениям формы клеток. После добавления ихфанов наблюдалось значительное уменьшение содержания дискоцитов (рис. 1а) и увеличение содержания эхиноцитов (рис. 16) по сравнению с контролем. В дальнейшем происходил обратный процесс: уменьшалось число эхиноцитов и возрастало содержание дискоцитов, появлялись и увеличивались в числе стоматоциты (рис. 1в). Из полученных данных следует, что эффективность трансформирующего действия и характер кинетической зависимости трансформации существенно различны в случае мембранного транспорта производных с разной структурой и гидрофобностью бокового алифатического заместителя.
Наименее гидрофобное соединение И(С-1) оказывало лишь незначительный эхиноцитоген-ный эффект. Наиболее выраженное увеличение содержания эхиноцитов на начальных стадиях инкубации и образование наибольшего количества стоматоцитов при увеличении времени инкубации вызывали производные, содержащие в углеводородной цепи бокового заместителя 8, 10, и 12 углеродных атомов. Из них максимальным мо-
дифицирующим эффектом обладало соединение И(С-8) (рис. 1а, в).
Производное И(С-16) с самым объемным и гидрофобным боковым заместителем отличалось от других производных ряда ихфанов как менее выраженным эхиноцитогенным эффектом, так и кинетикой морфологических трансформаций: индуцируемые им увеличение и снижение содержания эхиноцитов происходили на более поздних этапах по сравнению с другими производными.
Развивающиеся во времени изменения морфологии эритроцитов при инкубации с ихфанами можно объяснить с позиций гипотезы сопряженного бислоя (Sheetz, Singer, 1974) следующим образом. Начальным этапом мембранного транспорта этих соединений является их интеркаляция во внешний мон
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.