ВЛИЯНИЕ ИММОБИЛИЗИРОВАННОГО ИНТЕРФЕРОНА a-2b НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ ПЕРИТОНЕАЛЬНЫХ МАКРОФАГОВ
Шитикова О. Г., Шерстобоев Е. Ю., Масная Н. В., Данилец М. Г., Трофимова Е.С., Лигачева А. А.
ФГБОУ «Научно-исследовательский институт фармакологии имени Е. Д. Гольдберга» СО РАМН, лаборатория иммунофармакологии, Томск, Россия
В рамках общей программы доклинического изучения были проведены эксперименты in vitro и in vivo по изучению влияния иммобилизированного интерферона a-2b и препарата сравнения - «Реаферон-ЕС» (при исследовании in vitro) и «Реаферон-ЕС-липинт» (при исследовании in vivo) на функциональную активность перитонеальных макрофагов мышей линии CBA/CaLac. In vitro изучали влияние препаратов на продукцию оксида азота и активность аргиназы перитонеальных макрофагов. In vivo оценивали фагоцитарную активность макрофагов после 5-ти дневного курсового введения препаратов. Было показано, что иммобилизированный IFN-a2b и реаферон-ЕС не вызывали стимуляцию продукции оксида азота перитонеальными макрофагами мышей, при этом реаферон-ЕС усиливал активность аргиназы, а иммобилизированный интерферон a-2b либо не влиял, либо умеренно её снижал. Курсовое применение иммобилизированного интерферона a-2b стимулировало фагоцитоз перитонеальных макрофагов более эффективно, чем препарат сравнения.
Ключевые слова: иммобилизированный интерферон a-2b, перитонеальные макрофаги, оксида азота, аргиназа
Препараты интерферона все больше
привлекают внимания ученых, за счет способности в физиологических концентрациях подавлять репродукцию вирусов без выраженных побочных действий на метаболизм клеток организма [1]. Однако препараты IFN имеют ряд недостатков. Являясь белком, IFN расщепляется ферментами желудочно-кишечного тракта, быстро подвергается абсорбции и выведению из организма [2]. Повысить биодоступность препаратов IFN возможно при применении современной технологии иммобилизации активного белка с полиэтиленгли-колем (ПЭГ) с помощью электронно-лучевого синтеза. Присоединение ПЭГ к молекуле IFN модифицирует фармакокинетические свойства белка, что увеличивает эффективность интерферонотерапии [3].
В настоящие время препараты IFNa наиболее широко применяются в клинической практике. У ^^ выявлена наибольшая противовирусная активность и выраженное им-муномодулирующее действие.
Характер иммуномодулирующий активности IFNa позволяет считать их важнейшим связывающими элементами между врожденным и приобретенным иммунными ответами [1]. Тип развивающегося иммунного ответа на антиген зависит, прежде всего, от поведения антигенпрезентирующей клетки (макрофага и дендритной клетки) [4]. В связи с этим, при изучении механизмов действия лекарственного средства на основе иммобилизиро-ванного интерферона-а2Ь (имм^^а2Ь) мы особое внимание уделили влиянию исследуемого препарата на функциональное состояние макрофагов.
Материал и методы. Эксперименты были проведены на 70 мышах-самцах линии СВА/ CаLаc с 6-8-недельного возраста с массой тела 18-22 г, полученные из отдела экспериментальных биологических моделей ФГБУ «НИИ фармакологии имени Е. Д. Гольдберга» СО РАМН (сертификат имеется).
В работе использовали интерферон а-2Ь иммобилизированный (имм^^а2Ь) с по-
мощью ионизирующего излучения на по-лиэтиленгликоле (ПЭГ) с молекулярной массой 1,5 кДа, (производства ЗАО «Сибирский центр фармакологии и биотехнологии», г. Новосибирск). В качестве препарата сравнения применяли «Реаферон-ЕС» (РФН-ЕС) при исследовании in vitro и «Реаферон-ЕС-липинт» (РФН-ЕС-л) при исследовании in vivo (производитель ЗАО «Вектор-Медика», Новосибирск). Имм^^а2Ь и препарат сравнения добавляли в культуру перитонеальных макрофагов в дозах 150 МЕ/мл, 1500 МЕ/мл, 5000 МЕ/мл (в пересчете на интерферон) и вводили животным внутрижелудочно курсом в течение 5-ти суток в терапевтической дозе (ТД) (1,8 х 105 МЕ/кг).
Влияние имм^^а2Ь и РФН-ЕС на функциональную активность перитонеальных макрофагов in vitro оценивали по метаболизму ими аргинина (продукция оксида азота и активность аргиназы). Макрофаги выделяли из суспензии перитонеальных клеток методом прилипания к пластику и культивировали в стандартных условиях [5]. В надосадке оценивали продукцию оксида азота (NO) по содержанию нитритов при помощи реактива Грейса [6]. А в клетках оценивали активность аргиназы по способности клеточного гомоге-ната образовывать мочевину [7]. В качестве контроля был использован стандартный активатор макрофагов - липополисахарид E. coli (ЛПС) в дозе 1 мкг/мл.
Фагоцитарная активность перитонеальных макрофагов в опытах in vivo оценивалась через 24 ч после окончания 5-ти дневного кур-
са введения препаратов по способности этих клеток поглощать суточную культуру Staph. aureus, штамм 209 (получена с кафедры микробиологии ГБОУ ВПО СибГМУ); концентрация взвеси микробов - 20 млн/мл). Контрольные животные получали в эквивалентном объеме растворитель (фосфатно-солевой буфер). О фагоцитарной функции судили по проценту макрофагов, поглотивших микробы, и среднему число стафилококков, поглощенное одной клеткой [5].
Статистическая обработка результатов осуществлялась с применением пакета статистических программ Statistica for Windows (версия 5.0) с предварительной оценкой нормальности распределения и использованием t-критерия Стьюдента. Для выборки подчиняющейся нормальному распределению вычисляли среднее значение величины признака M и ошибку средней (m).
Результаты и обсуждение. Макрофаги являются одним из звеньев, связывающих врождённый и приобретенный иммунитет, благодаря способности презентировать иммунокомпе-тентным клеткам чужеродные антигены, выделять хемокины, привлекающие лимфоциты к очагу воспаления, а также вырабатывать ци-токины, способствующие протеканию иммунологических реакций. От поведения макрофага в первую фазу иммунного воспаления зависит направление иммунного ответа в сторону развития либо Th1 либо Th2 [4]. Изучение влияния имм^^а2Ь и РФН-ЕС на продукцию NO и активность аргиназы позволяет
Таблица. Влияние иммобилизированного интерферона-а2Ь и реаферона-ЕС на метаболизм аргинина перитоне-альными макрофагами мышей линии СВА/CaLac (М±т)
Исследуемое вещество Концентрация вещества Концентрация нитритов, мкМ Активность аргиназы, ЕА
Контроль 1 (среда) - 3,16±0,19 13,2±1,5
Контроль 2 (+ЛПС) 1 мкг/мл 68,09±0,82* 4,2±0,3*
Реаферон-ЕС 150 МЕ/мл 2,57±0,05^ 44,3±3,2*^
1500 МЕ/мл 3,29±0,19^ 26,3±1,1^
5000 МЕ/мл 3,88±0,23^ 34,1±2,1*^
Иммобилизиров анный интерферон-а2Ь 150 МЕ/мл 2,75±0,17^ 4,0±0,4*"
1500 МЕ/мл 2,56±0,11" 12,6±0,6"
5000 МЕ/мл 2,39±0,30" 8,4±0,4"
Примечание: *различие с контролем 1 достоверно, р<0,05; • - различие с контролем 2 достоверно, р<0,05; «различие имм№^а2Ь с соответствующей дозой реаферона-ЕС достоверно, р<0,05. Количество мышей в каждой группе - 10 голов.
судить о классической или альтернативной активации макрофагов. У классически активированных макрофагов L-аргинин с помощью фермента NO-синтазы преобразуют в оксид азота и цитруллин; при альтернативной активации макрофагов L-аргинин посредством аргиназы гидролизуется в орни-тин и мочевину [7].
В результате проведенного исследования было показано, что культивирование перито-нальных макрофагов с ЛПС приводило к классической активации клеток. В культурах клеток инкубированных с ЛПС значительно повышалась продукция оксида азота и снижалась активности аргиназы (табл.). Добавление РФН-ЕС во всех используемых концентрациях не оказывало влияния на NO-стимулирующую активность макрофагов. При этом активность аргиназы была достоверно выше как контрольных значений, так и показателей стимулированных ЛПС макрофагов (табл.).
Эти результаты свидетельствуют в пользу альтернативной активации макрофагов. При добавлении РФН-ЕС в культуру макрофагов в дозе 150 МЕ/мл активность аргиназы относительно контроля увеличивались в 3,3; 1500 МЕ/мл - в 2; 5000 МЕ/мл - 2,6 раза. Добавление имм^^а2Ь в культуру клеток в выбранных концентрациях также не приводило к усилению продукции оксида азота. Культивирование макрофагов с имм^^а2Ь (150 МЕ/мл) приводило к существенному снижению активности аргиназы: в 3,3 раза по сравнению с контрольными значениями, что не отличалось от значений показателя на фоне стимуляции ЛПС. В концентрациях 1500 и 5000 МЕ/мл имм^^а2Ь не влиял на активность изучаемого фермента. Анализ результатов показал, что добавление имм^^а2Ь снижало концентрацию NO в 1,3 раза (1500 МЕ/мл) и в 1,6 раза (5000 МЕ/мл), по сравнению с использованием аналогичных концентраций РФН-ЕС, соответственно (табл.). Полученные результаты свидетельствуют о снижении биологической активности имм^^а2Ь in vitro в результате модификации с ПЭГ. Однако эти изменения, вероятно, не являются следствием нарушение структуры белка, а связаны в первую очередь с изменением передачи внутриклеточных сигналов при взаимодействии пегилированного IFN с рецептором [2]. Несмотря на снижение активности имм^^а2Ь in vitro, иммобилизи-рованый препарат стимулировал фагоцитоз
перитонеальных макрофагов in vivo эффективнее, чем РФН-ЕС-л. Курсовое введение имм^^а2Ь и РФН-ЕС-л в 1 ТД не приводило к достоверным изменениям фагоцитарного индекса перитонеальных макрофагов экспериментальных животных по сравнению с контрольной группой. Однако повышалось среднее количество поглощенных одной клеткой бактерий у мышей, получавших имм^^а2Ь (8,83±1,47), относительно контроля (5,15±0,44) и группы препарата сравнения (4,53±0,25). Из литературы известно, что IFN I типа стимулируют фагоцитарную функцию макрофагов за счет увеличения экспрессии главного комплекса гистосовместимости I и II классов [8]. Вероятно, иммобилизация с ПЭГ, не изменяя структуру нативного IFN, увеличивает биодоступность препарата, тем самым сохраняя иммунотропное действие IFN-a2b. Выводы:
1. Иммобилизированный IFN-a2b и реаферон-ЕС in vitro в дозах 150 МЕ/мл, 1500 МЕ/мл, 5000 МЕ/мл не вызывали стимуляцию продукции оксида азота перитонеальными макрофагами мышей.
2. Добавление в культуры клеток иммобили-зированного интерферона a-2b в дозе 150 МЕ/мл снижало, в дозах 1500 МЕ/мл, 5000 МЕ/мл не влияло на активность аргиназы, реаферона-Е
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.