БИОФИЗИКА, 2014, том 59, вып. 1, с. 112-117
== БИОФИЗИКА КЛЕТКИ= ==
УДК 57.017.3: 621.373.826
ВЛИЯНИЕ in vitro И in vivo РЯДА ИНГИБИТОРОВ СИГНАЛЬНЫХ КАСКАДОВ НА ПРОДУКЦИЮ ЦИТОКИНОВ И СИГНАЛЬНЫХ БЕЛКОВ В МАКРОФАГАХ RAW 264.7 И В ЛИМФОЦИТАХ МЫШЕЙ
© 2014 г. Т.В. Новоселова, О.В. Глушкова, С.Б. Парфенюк, М.О. Хренов, С.М. Лунин, Т.И. Смолихина, Е.Е. Фесенко, Е.Г. Новоселова
Институт биофизики клетки РАН, 142290, ПущиноМосковской области, ул. Институтская, 3
E-mail: elenanov_06@mail.ru Поступила в p едакцию 10.10.13 г.
Исследовано влияние in vitro и in vivo нескольких ингибиторов активности сигнальных каскадов NF-kB, SAPK/JNK и рецептора TLR4 на функциональную активность иммунных клеток. Для исследований в условиях in vitro использовали макрофагальные клетки линии RAW 264.7, которые культивировали в присутствии каждого из следующих ингибиторов: IKK Inhibitor XII, SP600125, CLI-095 и OxPAPK (соответственно, ингибитор каскада NF-kB, каскада SAPK/JNK, а последние два соединения - ингибиторы активности рецептора TLR4). В целом все использованные ингибиторы не вызывали провоспалительного ответа в клетках RAW 264.7. Напротив, ингибитор каскада SAPK/JNK и особенно каскада NF-kB вызывали заметное угнетение продукции TNF-a, IL-1, IL-6, IFN-y и IL-10 в клетках RAW 264.7. В этих же клетках присутствие ингибиторов в основном снижало «фоновый стрессовый ответ» макрофагов, в разной степени подавляя продукцию белков теплового шока, HSP72 и HSP90-a, и снижая уровень фосфорилирования сигнальных белков из каскадов NF-kB и SAPK/JNK. Pезультаты исследований in vitro показали, что наиболее эффективным был ингибитор активности каскада NF-kB. Именно этот ингибитор использовали в условиях in vivo путем внутрибрюшинного введения мышам-самцам линии Balb/C для выяснения его влияния на активность клеток иммунной системы. Pезультаты исследований in vivo показали, что IKK Inhibitor XII не вызывал провоспалительного ответа у животных, он снижал активность каскада NF-kB и уменьшал экспрессию белка HSP90-a в лимфоцитах селезенки мышей. Таким образом, среди всех исследованных соединений IKK Inhibitor XII является самым эффективным ингибитором, который может быть использован для снижения цитокинового и стрессового ответа при различных патологиях.
Ключевые слова: цитокины, каскады NF-kB, SAPK/JNK и TLR4, ингибиторы сигнальных каскадов, клетки RAW 264.7, мыши Balb/C, лимфоциты селезенки.
Открытие и интенсивное исследование семейства рецепторов TLR's (Toll-like гесер1юге), ответственных за первичную связь бактер иаль-ных токсинов с клетками-мишенями, позволило выявить роль этих рецепторов в патогенезе множества патологий, затрагивающих вр ожден-ный и адаптивный иммунитет [1-3]. Несмотря на то, что у млекопитающих семейство этих рецепторов включает более двенадцати членов, наиболее исследуемый в настоящее время рецептор TLR4 был открыт первым. Первоначально он был охарактеризован как рецептор, распознающий липополисахарид из грамотри-цательных бактерий [4]. Липополисахарид из стенок грамотрицательных бактерий хорошо известен в качестве самого эффективного токсина, индуцир ующего воспаление и сепсис. Он является специфическим лигандом для TLR4,
который экспрессируется на поверхности моноцитов/макрофагов и многих других клеток. Уникальность ТЬИ4 среди членов семейства ТЬИ^ со стоит в том, что для р аспознавания лиганда рецепто р использует в качестве кор е-цепторов три дополнительных белка - ЬБР, СБ14 и МБ-2 [5-7].
Были выяснены механизмы, контролирующие связь между распознаванием эндотоксина с участием ТЬИ4 и внутриклеточными сигнальными путями, приводящими к активации и транслокации КБ-кБ в ядро и последующей продукцией провоспалительных цитокинов [4]. Это открытие дало старт целой серии работ, целью которых был поиск агентов, способных предотвратить активацию ТЬИ и, таким обра -зом, снизить токсический эффект патогенных микроорганизмов. Поиск показал, что имеется
целый ряд эндогенных веществ, которые способны модулир овать экспрессию TLR-рецепто -ров, воздействуя на активность сигнальных каскадов. В последнее время в мировой литературе стали появляться работы, направленные на поиск ингибиторов, которые подавляют различные сигнальные пути [8-12]. Механизмы действия этих ингибиторов пока изучены недостаточно, однако очевидно, что они представляют интерес в качестве агентов, способных снижать уровень токсических реакций при различных патологиях.
Целью настоящей работы было изучение эффектов in vitro и in vivo нескольких ингибиторов сигнальных каскадов NF-kB, SAPK/JNK и сигнального пути TLR4 на функциональную активность макрофагов RAW 264.7, которую оценивали, измеряя продукцию цитокинов (ФНО-а, ИЛ-1а, ИЛ-6, ИЛ-10, ИФН-у), экспрессию индуцибельных форм белков теплового шока HSP72 и HSP90-a и ур овень фосфорили-рования сигнальных белков из каскадов NF-kB, SAPK/JNK, а также экспрессию р ецепто ра TLR4. В работе использовали следующие ингибиторы: OxPAPC (ингибитор TLR2 и TLR4), CLI-095 (ингибитор TLR4 рецептора), SP600125 (JNK ингибитор) и IKK Inhibitor XII (ингибитор активности каскада NF-kB). Эти ингибиторы были выбраны для сравнения их эффективности и для оценки их возможной токсичности в условиях in vitro и in vivo (соответственно, линия клеток RAW 264.7 и лимфоидные клетки мышей). Полученные сведения будут полезными для дальнейших исследований эффективности этих ингибиторов для подавления патологических процессов в клетке в условиях окислительного стресса, вызывающего чрезмерную активацию компонентов системы сигнальной трансдукции.
МАТЕPИАЛЫ И МЕТОДЫ
Эксперименты в условиях in vitro. Клетки линии RAW 264.7 культивировали в среде RPMI 1640, с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и антибиотиков (пенициллин 100 мкг/мл, стрептомицин 100 мкг/мл, ген-тамицин 50 мкг/мл), при 37°C и 5% СО2. Для проведения анализа по 106 клеток в 1 мл помещали в 24-луночные планшеты (для определения продукции цитокинов) или по 107 клеток в 1 мл в культур альные флаконы (для определения продукции сигнальных и стрессовых белков) и культивировали до образования монослоя. Ингибиторы (30 мкг/мл OxPAPC, Invivo-Gen, ОТА; 1 мкг/мл CLI-095, InvivoGen, ОТА; 2,2 мкг/мл SP600125, Stressgen, CША; или
5,58 мкг/мл IKK Inhibitor XII, Германия) добавляли к клеткам и инкубировали (при 37°C и 5% C О2) либо 24 ч (для измерения продукции цитокинов), либо 6 ч (для измерения продукции сигнальных и стрессовых белков). Для каждого измерения использовали не менее четырех образцов клеток. Выживаемость клеток оценивали с использованием камеры Горяева, подсчет клеток проводили после их окрашивания смесью 0,01% трипанового синего - 0,01% эозина (1:1).
Эксперименты в условиях in vivo. Ингибитор IKK Inhibitor XII вводили внутрибрюшинно мышам-самцам линии Balb/с в количестве 4 мг/кг массы тела за 6 ч до эксперимента. Кровь собирали при декапитации, сыворотку крови получали после центрифугирования при 200 g. Ткань селезенки гомогенизировали и проводили гемолиз эритроцитов с использованием 0,83% раствора хлористого аммония в физиологическом растворе. Полученные лимфоциты селезенки суспендировали в физиологическом растворе, подсчитывали и использовали для измерения содержания сигнальных и стрессовых белков.
Измерение содержания цитокинов, белков теплового шока и сигнальных белков. Концентрацию цитокинов в сыворотке крови и в су-пернатантах клеток RAW 264.7 определяли методом ELISA с использованием набор ов антител (Murine ELISA Development Kits, PeproTech EC, Великобритания) для ФНО-а, ИЛ-6, ИФН-у, ИЛ-1, ИЛ-10. Для определения сигнальных и стрессовых белков применяли Вестерн-блот анализ, используя мышиные антитела к одному из белков теплового шока (StressGen BioteA-nologies, Канада): HSP70 (HSP72, клон SPA-812,) или HSP90 (HSP90 - а, клон SPA-828) или к одному из сигнальных белков (Cell Signaling, CША): ph-NF-кВ (ph-NF-кВ р65); ph-SAPK/JNK (Thr183/Tyr185); phIKK (Ser 176/180) и TLR4 (#2246), изобр ажения блотов получали используя систему ECL (Amersham, Швеция). Количественную оценку проводили с использованием программы Qapa. Cтатиcтичеcкий анализ проводили с использованием критерия C тьюдента.
PЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
При исследовании эффектов ингибиторов в условиях in vitro на первом этапе оценивали выживаемость клеток RAW 264.7, культивируемых в среде с ингибиторами. Было показано, что выживаемость клеток в присутствии каждого из ингибиторов составляла не менее 91 ± 5% (n = 5, p < 0,05), а выживаемость клеток
Рис. 1. Влияние ингибиторов на продукцию цитокинов клетками линии RAW 264.7. Каждое значение - среднее из пяти независимых экспериментов, в процентах от контроля. А - ингибитор CLI-095, Б - SP600125, В -IKK Inhibitor XII, Г - OxPAPK. 1 - TNF-a, 2 - IL-1, 3 - IL-6, 4 - IFN-y, 5 - IL-10. * - Достоверное отличие от контроля, p < 0,05.
в контрольных образцах - 95 ± 5% (n = 5, p < 0,05). Таким образом, в условиях эксперимента in vitro ингибиторы достоверно не увеличивали гибель клеток RAW 264.7. В экспер иментах in vivo при введении IKK Inhibitor XII также не было выявлено достовер ного изменения количества лимфоцитов селезенки у мышей (данные не показаны).
Влияние ингибиторов in vitro на продукцию цитокинов. На рис. 1 показано влияние использованных ингибиторов на продукцию цитокинов клетками RAW 264.7. Следует отметить, что в целом ингибиторы не вызывали очень больших изменений продукции цитокинов. Достоверное увеличение отмечено только для ИЛ-6, продукция которого незначительно увеличивалась в клетках, инкубированных с ингибитором CLI-095 (рис. 1, панель А), а более заметную активацию синтеза этого цитокина показали в присутствии ингибитора ОхРАРС (панель Г). Это показывает, что незначительный токсический эффект на клетки RAW 264.7 оказывают ингибитор ы TLR4-pецептоp а. Напротив, специфические ингибиторы внутриклеточных сигнальных каскадов, SP600125 и особенно IKK Inhibitor XII, вызывали достоверное угнетение синтеза цитокинов в культивир ованных макро -фагах (панели Б и В). Снижение синтеза про -воспалительных цитокинов, TNF-a, IL-1, IL-6, IFN-y, а также антивоспалительного
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.