УДК 618.14-006-092.9
ВЛИЯНИЕ ИНГИБИТОРА ПРОТЕАСОМ БОРТЕЗОМИБА НА ЭКСПРЕССИЮ И АКТИВНОСТЬ АВС-ТРАНСПОРТЕРОВ
В ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТКАХ © 2010 г. Л. А. Панищева, Е. С. Какпакова, Е. Ю. Рыбалкина, А. А. Ставровская
Институт канцерогенеза Учреждения Российской академии медицинских наук Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва; электронная почта:panlidia@gmail.com Поступила в редакцию 10.07.2009 г.
В представленной работе исследована роль транспортеров семейства АВС в эволюции новообразований, подвергнутых действию бортезомиба. Бортезомиб (PS—341, \eicade) — специфический ингибитор активности протеасом, применяемый при некоторых злокачественных новообразованиях. В качестве моделей мы выбрали несколько пар клеточных линий, отличающихся по экспрессии Pgp (Р-гликопротеин, он же транспортер АВСВ1). Показано, что гиперэкспрессия Pgp может по разному влиять на чувствительность к бортезомибу опухолевых клеток разной тканевой принадлежности. Бортезомиб влиял на содержание мРНК генов MDR1 (АВСВ1) и MRP1(ABCC1), что свидетельствует о возможном подавлении активности каких-то регуляторов генов/белков МЛУ этим ингибитором протеасом. Обработка бортезомибом приводила к возрастанию количества клеток, экспрессирую-щих АВС-транспортеры (Pgp, или MPR1) в трех из четырех исследованных клеточных популяций. Показано, что в среде с бортезомибом Pgp остается активным. С помощью метода ШС2-антитель-ного сдвига (UIC2-shift assay) мы показали, что бортезомиб в некоторых случаях может активировать Pgp, т.е. бортезомиб влияет на конформацию Pgp, и под его влянием возникает активная кон-формация этого белка. Эти опыты впервые прямо показывают, что бортезомиб является субстратом Pgp.
Ключевые слова: ингибитор протеасом, транспортные белки семейства АВС, множественная лекарственная устойчивость.
Множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) опухолевых клеток является серьезным препятствием на пути химиотерапии злокачественных новообразований. МЛУ — это система защиты популяции опухолевых клеток от лекарственных средств, различающихся по химической структуре и механизму действия на клетку [1, 2]. МЛУ—важный фактор, определяющий эволюцию популяций ма-лигнизированных клеток. Среди других причин лекарственной устойчивости опухолей человека на сегодняшний день хорошо охарактеризована повышенная активность белка семейства АВС (ATP-binding cassette) — АВСВ1, или Р-гликопротеина (Pgp), кодируемого геном MDR1 (АВСВ1). Pgp, используя энергию АТР, транспортирует группу различающихся по структуре веществ из цитозоля и/или из плазматической мембраны во внеклеточное пространство [3]. Ранее нами были получены данные, свидетельствующие в пользу того, что противоопухолевый препарат, ингибитор тирозинки-наз иматиниб (Gleevec), может "отбирать" клетки, гиперэкспрессирующие Pgp и другие АВС-транс-портеры. Такие клетки, возможно, являются стволовыми опухолевыми клетками [4]. Таким образом, селекция противоопухолевыми препаратами нового поколения (препаратами, направленными на мишень, или таргетными препаратами) клеток, ги-
перэкпсрессирующих АВС-транспортеры, может оказаться фактором, способствующим размножению клеток, которые поддерживают существование новообразования.
В настоящее время активно изучается новый класс противоопухолевых соединений, действие которых направлено на подавление активности протеасом, так как деградация белков является одним из важнейших процессов, связанных с нормальным функционированием клетки. Показано, что ингибирование активности протеасом приводит к апоптозу. Один из наиболее известных и уже применяемых в терапии множественных миелом, лимфом и некоторых других опухолей ингибиторов протеасом — бортезомиб (Р8—341, Уе1еаёе). Этот мощный селективный ингибитор протеасом представляет собой водорастворимый дипептид боро-никовой кислоты, который, ковалентно связываясь с активным центром коровой части протеасомы, способен подавлять ее химотриптическую активность [5]. Механизмы и закономерности эволюции популяций малигнизированных клеток, подвергнутых воздействию бортезомиба, не ясны, как, в частности, и участие АВС-транспортеров в этом процессе. Данные о роли Р£р в связывании бортезоми-ба противоречивы. В одной из работ на линиях
клеток лимфобластов и глиобластомы показано, что бортезомиб не является субстратом Pgp [6]. Однако на других линиях клеток получены данные, свидетельствующие в пользу того, что бортезомиб — субстрат белка Pgp [7—9].
В представленной работе для изучения роли АВС-транспортеров в эволюции новообразований, подвергнутых воздействию бортезомиба, мы попытались выяснить, является ли бортезомиб субстратом Pgр, и влияет ли бортезомиб на экспрессию генов и на количество клеток, экспрессирующих АВС-транспортеры. Мы использовали метод, показывающий, что бортезомиб связывается с Pgp, кон-формация белка изменяется.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Реагенты, использованные в работе. Бортезомиб (Velcade; "BEN VENUE Laboratories, Inc"., США). Винбластин (Vbl; "Гедеон Рихтер", Венгрия). Родамин (Rhodamine 123 (Rh123); "Sigma"). Антитела (АТ) против Р-гликопротеина UIC2 (CD243-PE; Beckman Coulter); AT Anti-mouse IgG (H + L) меченные фикоэритрином ("Vector Laboratories, Inc", Burlingame); AT MRP1 ("Chemicon"); AT Rbt x Ms IgG fluor ("Chemicon").
Клеточные линии. Линию клеток хронического миелолейкоза человека К562 [10] и ее сублинию, ги-перэкспрессирующую Pgр (K562/i-S9) [11] поддерживали на среде RPMI 1640 с 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота. Также использовали линию клеток острого миелобластного лейкоза KG1 человека [12], пассируемую на среде Iscove's MDM с 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота. Клетки эпидермоидной карциномы ротовой полости человека КВ 3—1 и клетки сублинии КВ, гиперэкспрессирующие Pgр, отобранные по резистентности к колхицину (КВ 8—5) [13], вели на среде DMEM с 10% сыворотки. Все клеточные линии культивировали при температуре 37°С в атмосфере 5% С02.
МТТ-тест. Метод основан на способности ми-тохондриальных дегидрогеназ живых клеток превращать "желтый" МТТ — 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолийбромид — в "синий" формазан. Детали метода описаны ранее [14]. Для каждого препарата ставили не менее трех независимых экспериментов.
Метод антительного сдвига (UIC2-shift assay, или UIC2-ОАС). Метод основан на том, что АТ UIC2 узнают Pgр, когда он активирован в результате связывания с субстратом и изменил свою конформа-цию [15]. Для выявления связывания АТ UIC2 с активированным Pgp клетки до конъюгации с АТ обрабатывали в течение 15 мин бортезомибом или винбластином в концентрации 2 x 10-8 М. Конъю-гирование проводили на нефиксированных клетках
(5—10 х 105 клеток) в100мкл фосфатного буфера (pH 7.4) с АТ CD243-PE (инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре). Затем клетки осаждали центрифугированием (5 мин при 1000g ) и трижды промывали 10-кратным объемом фосфатного буфера. В качестве контроля использовали флуоресценцию клеток, обработанных изотип-спе-цифичными АТ коньюгированными с фикоэритрином. Клетки анализировали на проточном цитофлуориметре BECTON DICKINSON.
Иммуноцитохимический анализ белков множественной лекарственной устойчивости. Метод описан ранее [16]. В работе использовали монокло-нальные АТ к белку транспортеру MRP1. Клетки инкубировали с бортезомибом в эффективных дозах IC20 и IC50 (дозы препарата, при которых наступает гибель 20 или 50% клеток) в течение 72 ч, затем клетки фиксировали в растворе 4% параформальде-гида и инкубировали в 0.1% растворе тритона X-100 в течение 15 мин, после чего коньюгировали с соответствующими АТ в течение 1 ч при комнатной температуре. Далее клетки коньюгировали со вторыми АТ анти-мышь, меченными флуоресцентным красителем FITC, в течение 40 мин при комнатной температуре. Для фиксации комплекса антиген-антитело осадок клеток ресуспендировали в 1% растворе формальдегида в фосфатном буфере. Для оценки количества белка Pgp нефиксированные клетки инкубировали в течение 40 мин с АТ CD243-PE, меченными фикоэритрином. В качестве контрольной флуоресценции использовали флуоресценцию клеток, обработанных только вторыми АТ. Образцы анализировали на проточном цитофлуо-риметре BECTON DICKINSON с использованием программы Cell Quest по двум показателям: оценивали процент положительно окрашенных клеток в образце и показатель средней светимости каждого образца. Анализировали не менее 10000 клеток в каждой пробе.
Выделение РНК и ОТ-ПЦР. Процедура описана ранее [16]. Суммарную РНК выделяли при помощи TRI Reagent ("Sigma") в соответствии с протоколом производителя. Реакцию обратной транскрипции (ОТ) проводили с использованием гексамерных праймеров. Для выравнивания количества кДНК в разных образцах амплифи-цировали ген домашнего хозяйства GAPDH. Для амплификации продуктов нужной длины использовали следующие специфические прай-меры: GAPDH 513 п.н. (CCCCTGGCCAAGGT-CATCCATGACAACTTT (прямой), GGCCATGAG-GTCCACCACCCTGTTGCTGTA (обратный)); MDRl 167 п.н. (CCCATCATTGCAA-TAGCAGG (прямой), GTTCAAACTTCTGCTCCTGA (обратный)); MRP1 180 п.н. (ATCAAGACCGCTGTCAT-TGG (прямой), GAGCAAGGATGACTTGCAGG (обратный); BCRP 172 п.н. (TGCCCAGGACT-
125 г
100
75 "
3
§ 50
25
125
£100
10 20 30 40 50 Концентрация \ЪС, 10-8 М
Рис. 1. Оценка цитотоксического действия бортезо-миба (УЬС) на клетки линий К562 (1), К562/1-89 (2) и КО1 (3). МТТ-тест. Результаты одного репрезентативного опыта. Ставили три опыта, которые дали сходные результаты. Эффективные дозы: К562 — 1С20 - 2.5 х 10-8 М, 1С50 - 5 х 10-8 М; К562/1-89 -1С20 - 1.25 х 10-8 М, 1С50 - 2.5 х 10-8 М; КО1 - 1С20 -3.2 х 10-9 М, 1С50 - 1.25 х 10-8 М.
СААТОСААСАО (прямой), АСААТ-ТТСЛОО-ТЛООСААТТОТО (обратный); LRP 405 п.н. (CCCCCATACCACTATATCCATGTG (прямой), TCОAAДAОCCДCTОДTCTCCTО (обратный)). Условия амплификации: 30 с при 94°С, затем 25 циклов: 10 с при 94°С, 10 с при 60°С, 10 с при 72°С, затем 1 мин при 72°С. Продукты амплификации в объеме 20 мкл реакционной смеси разделяли электрофорезом в 2% агарозном геле с бромистым этидием. Гель фотографировали при помощи цифровой видеокамеры.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.