ОНТОГЕНЕЗ, 2004, том 35, № 5, с. 346-349
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЭМБРИОЛОГИЯ
УДК 591.393:615.015.1
ВЛИЯНИЕ ИНГИБИТОРОВ NO-СИНТАЗ НА ПОКАЗАТЕЛИ ЭМБРИОНАЛЬНОЙ ГИБЕЛИ ПРЕ-И ПОСТИМПЛАНТАЦИОННЫХ ЭМБРИОНОВ МЫШЕЙ
© 2004 г. Т. В. Блашкив, Т. Ю. Вознесенская
Институт физиологии им. A.A. Богомольца HAH Украины 01027 Киев, ул. Богомольца, д. 4 Поступила в редакцию 25.02.03 г. Окончательный вариант получен 04.11.03 г.
Исследовали влияние ингибиторов NO-синтаз, угнетающих все изоформы NO, на показатели эмбриональной гибели и появление морфологических особенностей пре- и постимплантационных эмбрионов мышей. Изучение частоты эмбриональной гибели показало, что у самок опытных групп при скрещивании их с интактными самцами происходит увеличение пре- и постимплантационной смертности эмбрионов в ранние сроки после введения препаратов. Изучение морфологических особенностей эмбрионов выявило замедление эмбрионального развития на стадии дробления и в ходе гаст-руляции. Результаты свидетельствуют о том, что NO является важным регулятором клеточной пролиферации и дифференцировки у эмбрионов мышей, в особенности в пре- и постимплантационный период развития.
Ключевые слова: мышь, эмбрион, предымплантация, постимплантация, гибель, ингибиторы NO-синтазы.
Оксид азота (NO) образуется из L-аргинина при участии фермента цитозоля NO-синтазы (NOS). Существует два класса NOS: конститутивные (eNOS, nNOS), которые постоянно экспрес-сируют и используют кальций/кальмодулин в качестве кофактора, и индуцибельная (iNOS), которая продуцирует NO в случае необходимости и независима от кальция. Присутствие eNOS, nNOS и iNOS в репродуктивных органах доказано методами биохимии и иммуногистохимии (Van Voorhis et al., 1995; Zackrisson et al., 1996). Показана также экспрессия eNOS и iNOS в цитоплазме ооцитов и эмбрионов во время предымплантационного развития и eNOS в ядрах эмбрионов (Nishikimi et al., 2001). Предполагается, что NO необходим для нормального эмбрионального развития, поэтому исследована способность предыимплантацион-ных эмбрионов мышей продуцировать NO (Gouge et al., 1998). В то же время показано, что излишек NO индуцирует апоптоз в эмбрионах мышей (Chen et al., 2001). Исследовано изменение активности NOS и вклад изоформ eNOS и iNOS в пре-дымплантационный период развития эмбрионов. Установлено уменьшение активности NOS у эмбрионов в период развития от 4- до 8-клеточной стадии и ее возрастание вновь у эмбрионов на стадии морулы (Saxena et al., 2000; Nishikimi et al., 2001). Также изучено влияние ингибиторов NOS на предымплантационное развитие эмбрионов мышей in vitro (Nishikimi et al., 2001).
Цель работы - исследование влияния NOS на показатели эмбриональной гибели и морфологические особенности пре- и постимплантационных эмбрионов у самок мышей, которым ингибиторы NOS вводили до скрещивания с интактными самцами.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Использовали мышей линии СВА: 10 самок весом 16-20 г на каждую дозу NOS и в каждой контрольной группе и самцов-воспроизводителей весом 25 г. Для экспериментов отбирали самок на стадии проэструса. Проведено две серии экспериментов. В первой определяли показатели эмбриональной гибели, во второй - морфологические особенности пре- и постимплатанционных эмбрионов у самок, которым вводили ингибитор NOS до скрещивания с интактными самцами. Роль NO изучали с использованием неспецифических фармакологических ингибиторов предшественника NO, NOS: метилового эфира №-нитро-Ь-аргинина (L-NAME) и №-монометил-Ь-аргинина (L-NMMA), угнетающих все изоформы NOS. L-NAME и L-NMMA ("Sigma", США) вводили самкам мышей однократно внутрибрюшинно в дозах 2.5 и 3.5 мг/кг соответственно. Используемые дозы были подобраны по данным литературы (Naka-mura et al., 1999) и экспериментально в результате применяемых доз 0.70; 1.25; 2.50; 3.50 мг/кг на
Таблица 1. Влияние ингибиторов КО-синтаз на развитие эмбрионов мышей после имплантации
Концентрация ингибиторов NOS, мг/кг Число изученных эмбрионов Число эмбрионов на стадии развития
1 - цилиндрическая форма с четкой границей между зародышевой и внезародышевой областями (6-й день) 4 - формирование первичной полоски (7-й день) 6-7 - образование амниона; расширение амниотической полости (8-й день) 10-11 - сердце сокращается; кровообращение в висцеральном желточном мешке (9-й день)
Контроль 29 0/0 0/0 12/41.6 17/58.4
L-NAME, 2.5 28 19*/67.8 9*/32.2 0*/0 0*/0
L-NMMA, 3.5 25 14*/63.6 11*/36.4 0*/0 0*/0
* р < 0.01 - вероятность отличий групп данных относительно таковых на 10-й день беремености у самок, которым вместо ингибиторов NOS вводили физиологический раствор (контроль); вторые цифры - %.
самках мышей линии СВА. Контрольным животным вводили физиологический раствор тем же способом и в том же обьеме. Самок контрольных и опытных групп скрещивали с интактными самцами. Спаривание регистрировали по наличию вагинальной пробки. Дополнительным необходимым контролем для второй серии опытов являлись самки на 6-м дне беременности. На 10-12-й дни беременности под эфирным наркозом самок забивали и подсчитывали: А - количество живых эмбрионов; Б - число мест резорбции (число погибших эмбрионов); В - число желтых тел беременности. Показатели пре- и постимплантацион-ной гибели вычисляли по формулам ((В-А + + Б)/В) х 100% и (Б/(А + Б)) х 100% соответственно (Саноцкий, 1978).
Предымплантационные эмбрионы из яйцеводов и рогов матки извлекали промыванием. Нормальные жизнеспособные предымплантационные эмбрионы мыши определяли по следующим критериям: полупрозрачны, имеют правильную шаровидную или слегка эллипсоидную форму, внешняя оболочка (бластолемма) плотно прилегает к клеточной массе и практически не видна под микроскопом, при покачивании сосуда эмбрион легко смещается с места. У эмбрионов, чья жизнеспособность находилась под сомнением, внешняя оболочка отслаивалась от клеточной массы и становилась хорошо видна под микроскопом. Такие эмбрионы полупрозрачны и сохраняют шаровидную форму. Погибшие эмбрионы непрозрачны (матового цвета), а их внешняя оболочка сильно отслоена от клеточной массы. Клетки зародыша уменьшены в размерах, теряют типичную форму и образуют агрегат неправильной формы. При покачивании сосуда такой зародыш с трудом смещается (Лебедев, 1990).
Жизнеспособные эмбрионы классифицировали по стадиям по следующим морфологическим критериям. Стадия дробления - клетки имеют четкие границы, число клеток легко подсчитыва-ется и составляет от 2 до 8; стадия компактизации -
клетки уплощены, их число превышает 8; стадия деления (16-клеточная стадия) - происходит де-компактизация перед осуществлением митозов и рекомпактизация по завершении деления; формирование бластоцеля (начало кавитации, 32-клеточная стадия) - образуется наполненная жидкостью вакуоль. Число эмбрионов на каждой стадии выражали в процентах (Манк, 1990).
Извлечение постимплантационных эмбрионов и классификацию стадий их развития осуществляли так же (Манк, 1990). Жизнеспособные эмбрионы классифицировали по следующим морфологическим критериям: стадия 1 (6-й день) - цилиндрическая форма эмбриона с четкой границей между зародышевой и внезародышевой областями; стадия 4 (7-й й день) - формирование первичной полоски; стадии 6, 7 (8-й день) - образование амниона; расширение амниотической полости; стадии 10, 11 (9-й день) - сердце сокращается, имеет место кровообращение в висцеральном желточном мешке. Число эмбрионов на каждой стадии выражали в процентах. Для определения вероятности различий между группами данных использовали ¿-критерий Стьюдента при р < 0.01 и р < 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Изучение эмбриональной гибели показало, что у самок опытных групп при скрещивании их с интактными самцами наблюдалось увеличение пре- и постимплантационной гибели эмбрионов в ранние сроки после введения препаратов. Так, при введении Ь-КАМБ и Ь-КММА предымпланта-ционная гибель составила соответственно 8.2 ± 2.3 (р < 0.05) и 4.3 ± 1.7% при 2.7 ± 1.6% в контроле, а постимплантационная 7.1 ± 0.8 (р < 0.01) и 4.4 ± 0.7% при 1.3 ± 0.8% в контроле. Изучение морфологических особенностей постимплантационных эмбрионов показало замедление эмбрионального развития в ходе гаструляции, на стадии формирования первичной полоски (табл. 1). В 20% случаев
348 БЛАШКИВ, ВОЗНЕСЕНСКАЯ
Таблица 2. Влияние ингибиторов NO-синтаз на развитие эмбрионов мышей до имплантации
Концентрация ингибиторов NOS, мг/кг Число изученных эмбрионов Число эмбрионов на стадии
дробления; от 2 до 8 клеток компактизации; >8 клеток деления; 16 клеток формирования бластоцеля; 32 клетки
Контроль 18 0/0 0/0 5/28 13/72
L-NAME, 2.5 11 5*/45 6*/55 0*/0 0*/0
L-NMMA, 3.5 10 6*/60 4*/40 0*/0 0*/0
* р < 0.01 - вероятность отличий групп данных относительно таковых на 6-й день беремености у самок гибиторов NOS вводили физиологический раствор (контроль); вторые цифры - %. которым вместо ин-
в день наблюдения у самок отмечены отклонения в развитии предымплантационных эмбрионов по сравнению с контролем.
Изучение морфологических особенностей предымплантационных эмбрионов на 6-й день беременности у интактных самок показало, что происходит замедление эмбрионального развития на стадии дробления (табл. 2). В 20% случаев самки, которые были оплодотворены в течение первых 4 сут после введения как L-NAME, так и L-NMMA, оказались небеременными.
Таким образом, нами получены данные, свидетельствующие об увеличении показателей эмбриональной гибели у мышей, которым вводили ингибиторы NOS до спаривания. Изучение морфологических особенностей эмбрионов показало, что происходит замедление эмбрионального развития на стадии дробления и в ходе гаструля-ции. Это может быть результатом нарушений в фазе мейоза при созревании ооцитов, ведущих к гибели зигот, кроме этого можно предположить нарушение плодоматеринских взаимоотношений.
ОБСУЖДЕНИЕ
Известно, что во время созревания ооцитов в них происходят многочисленные структурные изменения. Это и реорганизация органелл при растворении зародышевого пузырька (Albertini, 1987), и формирование деления веретена (Albertini, 1992), и сегрегация хромосом (Longo, 1985). Вероятно, зрелые ооциты
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.