научная статья по теме ВЛИЯНИЕ ИНСУЛИНА, СИСТЕМЫ ГЛУТАТИОНА И СУПЕРОКСИДНОГО АНИОН-РАДИКАЛА НА МОДУЛЯЦИЮ ЛИПОЛИЗА В АДИПОЦИТАХ КРЫС С ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫМ ДИАБЕТОМ Химия

Текст научной статьи на тему «ВЛИЯНИЕ ИНСУЛИНА, СИСТЕМЫ ГЛУТАТИОНА И СУПЕРОКСИДНОГО АНИОН-РАДИКАЛА НА МОДУЛЯЦИЮ ЛИПОЛИЗА В АДИПОЦИТАХ КРЫС С ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫМ ДИАБЕТОМ»

БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 1, с. 111 - 122

УДК 577.125.2;616.379-008.64-021.6;577.175.722

ВЛИЯНИЕ ИНСУЛИНА, СИСТЕМЫ ГЛУТАТИОНА

И СУПЕРОКСИДНОГО АНИОН-РАДИКАЛА НА МОДУЛЯЦИЮ ЛИПОЛИЗА В АДИПОЦИТАХ КРЫС С ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫМ ДИАБЕТОМ

© 2015 В.В. Иванов, Е.В. Шахристова*, Е.А. Степовая, О.Л. Носарева, Т.С. Федорова, Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий

Сибирский государственный медицинский университет Минздрава России, 634050 Томск, Московский тракт, 2; факс: +8(3822)53-3309, электронная почта: office@ssmu.tomsk.ru, shaxristova@yandex.ru

Поступила в редакцию 14.05.14 После доработки 18.07.14

Установлено, что в адипоцитах крыс с аллоксановым диабетом увеличивается спонтанный липолиз, инги-бируется стимулированный изопротеренолом гидролиз триацилглицеролов на фоне окислительного стресса и снижения редокс-статуса клеток. Выявлено снижение способности инсулина ингибировать стимулированный изопротеренолом гидролиз триацилглицеролов в адипоцитах, изолированных из жировой ткани крыс с экспериментальным сахарным диабетом, что свидетельствует о нарушении регуляции гормоном ли-полиза в жировых клетках при аллоксановом диабете. На основании полученных данных сделан вывод о влиянии активных форм кислорода, в частности супероксидного анион-радикала, и редокс-потенциала системы глутатиона на молекулярные механизмы изменения интенсивности липолиза в адипоцитах крыс в условиях окислительного стресса, индуцированного аллоксаном. Активация спонтанного липолиза в условиях окислительного стресса может являться одной из причин повышенного содержания свободных жирных кислот в плазме крови при экспериментальном диабете, что может играть важную роль в развитии ин-сулинорезистентности и возникновении осложнений сахарного диабета.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: сахарный диабет, адипоциты, окислительный стресс, липолиз, система глутатиона, марганец-тетра (М-метил-4-пиридил) порфирин, М-этилмалеимид.

Развитие различных патологий, в частности сахарного диабета (СД), сопровождается нарушением процессов редокс-регуляции в клетках и формированием окислительного стресса [1]. Активные формы кислорода (АФК) оказывают регулирующее влияние на клетки посредством их участия в качестве вторичных мессенджеров в передаче сигналов, опосредованных лиганд-

Принятые сокращения: СД — сахарный диабет; АФК — активные формы кислорода; О" — супероксидный анион-радикал; ОН" — гидроксильный анион-радикал; ТБК-активные продукты — продукты, реагирующие с тио-барбитуровой кислотой; БЪ-еАМР — аналог сАМР (N(6)-2'-дибутирил-сАМР); Мп-ТМРуР — ловушка супероксидного анион-радикала (марганец-тетра(М-метил-4-пири-дил)порфирин); МЕМ — блокатор 8Н-групп (М-этилмале-имид); + — общий глутатион; — восста-

новленный глутатион; — окисленный глутатион; бе-

лок-88в — белково-связанный глутатион; ГПО — глутати-онпероксидаза; ТАГ — триацилглицеролы; ПОЛ — пере-кисное окисление липидов. * Адресат для корреспонденции.

рецепторными взаимодействиями, в т.ч. в трансдукции инсулинового сигнала [2]. В то же время нарушение баланса между про- и антиок-сидантами, гипергликемия и высокий уровень свободных жирных кислот при СД приводят к повышению уровня АФК, способствующих окислительному повреждению макромолекул (липидов, белков и нуклеиновых кислот), что лежит в основе патогенеза СД и развития осложнений, в т.ч. инсулинорезистентности [3—5]. Согласно современным представлениям важную роль в механизмах формирования инсули-норезистентности при СД играет жировая ткань [6]. В регуляции метаболических процессов в клетках, в т.ч. в адипоцитах, важную роль играет глутатион, который в комплексе с глутатионпе-роксидазой и глутатионредуктазой образует систему, обладающую антиоксидантной активностью. Эпидидимальная жировая ткань характеризуется высоким содержанием общего глута-тиона, но низким редокс-статусом и повышен-

ной чувствительностью системы глутатиона к окислительному стрессу [7].

Известно, что диабетогенное действие ал-локсана опосредовано продукцией АФК преимущественно в в-клетках островков Лангерган-са, обладающих низкой активностью ферментов антиоксидантной защиты. При этом аллоксан, восстанавливаясь в диалуровую кислоту, способствует продукции АФК, в частности супероксидного (О") и гидроксильного (ОН") анион-радикалов [8, 9]. Это позволяет использовать аллоксан в качестве прооксиданта для моделирования окислительного стресса в изолированных клетках.

Целью настоящего исследования являлось изучение активности спонтанного и стимулированного липолиза, эффектов инсулина в адипо-цитах крыс с аллоксановым диабетом, а также установление роли супероксидного анион-радикала в модуляции липолиза в изолированных адипоцитах крыс при окислительном стрессе, индуцированном аллоксаном.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проводили на 42 крысах-самцах Wistar массой 310 ± 50 г, полученных из вивария НИИ фармакологии имени Е.Д. Гольд-берга г. Томска. Животных содержали в стандартных условиях вивария на обычном рационе кормления при свободном доступе к воде и пище. Исследования проводились согласно «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ МЗ СССР № 755 от 12.08.1987 г.) и Федеральному закону «О защите животных от жестокого обращения» от 01.09.1997 г., а также с соблюдением конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей, принятой Европейским союзом в 1986 г., и директивы 86/609 ЕЭС.

Методом случайной выборки животные были распределены на группы: контрольную группу (12 крыс), опытную группу (10 крыс) и группу для экспериментов in vitro (20 крыс). На первом этапе работы в опытной группе экспериментальный диабет у крыс вызывали четырехкратной инъекцией аллоксана (90 мг/кг), животным контрольной группы с той же частотой и в том же объеме вводили физиологический раствор. Через две недели после введения ал-локсана и физиологического раствора животных усыпляли СО2-асфиксией, получали эпиди-димальную жировую ткань, из которой выделяли адипоциты с использованием коллагеназы («Sigma Aldrich», США) по методу Родбелл [10].

Концентрацию адипоцитов в суспензии доводили до 1 х 106 клеток в 1 мл с помощью разведения буфером, содержавшим 10 мМ Hepes («Sigma Aldrich», США), раствор Кребса—Рингера [10], 2% (m/V) БСА V фракции («ПанЭко», Россия) и 5 мМ глюкозы. Жизнеспособность выделенных клеток оценивали по окрашиванию трипано-вым синим («Serva», США). Доля живых клеток составляла не менее 95%.

Интенсивность липолиза оценивали по концентрации в среде инкубации адипоцитов гли-церола, определяемого ферментативным методом Виланда [11], и свободных жирных кислот, содержание которых регистрировали с помощью набора фирмы «RANDOX» (Великобритания) согласно протоколу производителя.

Для оценки интенсивности стимулированного липолиза и ингибирующего действия на него инсулина содержание глицерола определяли в инкубационной среде после трех часов инкубации адипоцитов в присутствии изопротери-нола (агонист ß2-адренорецепторов, «Sigma», США; 1 мкМ) [12] и инсулина («Sigma», США; 10 нМ) [13].

Об активности перекисного окисления в адипоцитах судили по содержанию гидроперекисей липидов, концентрацию которых регистрировали FOX-2 методом [14], и продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК-активных продуктов) — флуоресцентным методом Яги с соавт. [15].

Состояние антиоксидантной системы защиты в адипоцитах оценивали по содержанию общего, восстановленного и окисленного глутати-она, определяемого циклическим методом Андерсона [16], а также исследовали концентрацию белково-связанного глутатиона после осаждения белков 5%-ной (m/V) сульфосалици-ловой кислотой. Активность глутатионперокси-дазы оценивали по интенсивности окисления NADPH [17].

На втором этапе исследований проводили эксперименты in vitro на изолированных адипоцитах из эпидидимальной жировой ткани крыс. Окислительный стресс в адипоцитах индуцировали добавлением 5,0 мМ аллоксана («Sigma», США) [5]. Клетки инкубировали 3 ч при 37° в СО2-инкубаторе («Sanyo», Япония). Интенсивность спонтанного липолиза, а также стимулированного изопротеренолом (1 мкМ, «Sigma», США) [12] и аналогом сАМР - ^6)-2'-дибути-рил-сАМР (Db-cAMP) (0,5 мМ, «Sigma», США) [18] липолиза оценивали по содержанию глицерола в среде инкубации адипоцитов, определяемого ферментативным методом [11].

Для выявления влияния продуцируемого ал-локсаном OJ на липолиз в адипоцитах клетки

инкубировали с ловушкой супероксидного анион-радикала — марганец-тетра ^-метил-4-пи-ридил) порфирином (Mn-TMPyP) («Sigma», США) в конечной концентрации 100 мкМ [19]. Для оценки участия глутатиона в модуляции ли-полиза в адипоцитах в условиях окислительного стресса, индуцированного аллоксаном, клетки инкубировали с блокатором SH-групп — N-этил-малеимидом (NEM) («Sigma», США) в конечных концентрациях 0,2 и 0,8 мМ [20]. После инкубации адипоцитов с NEM в клетках определяли содержание восстановленной и окисленной форм глутатиона циклическим методом Андерсона [16], а также концентрацию белково-свя-занного глутатиона после осаждения белков 5%-ной (m/V) сульфосалициловой кислотой. Оценивали интенсивность спонтанного и стимулированного изопротеренолом липолиза по выходу глицерола в среду инкубации адипоци-тов [11].

При анализе полученных данных использовали методы статистического описания и проверки статистических гипотез с использованием программы SPSS 11.0 для Windows. Проверка на соответствие выборок нормальному закону распределения проводилась критерием Шапи-ро—Уилка. В связи с отсутствием соответствия данных нормальному закону распределения на уровне значимостиp < 0,01 ир < 0,05 вычисляли средневыборочные характеристики: медиана (Ме), первый и третий квартили (Qi—Q3). Достоверность различий выборок оценивали с по-

мощью непараметрических критериев Ман-на—Уитни и Краскала—Уолиса для малых групп. Различия считались достоверными при достигнутом уровне значимости р < 0,05 или р < 0,01. Межгрупповой анализ проводили с использованием непараметрического критерия Манна— Уитни.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В ходе экспериментальных исследований в адипоцитах эпидидимальной

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком