ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2015, том 460, № 4, с. 468-471
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 577.332.23: 539.199
ВЛИЯНИЕ ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ НА ЛЮМИНЕСЦЕНЦИЮ МИЦЕЛИЯ СВЕТЯЩЕГОСЯ ГРИБА МгопоМорапиБ иашЫ
© 2015 г. В. С. Бондарь, А. П. Пузырь, А. Е. Буров, С. Е. Медведева, Э. К. Родичева, Т. В. Кобзева, А. Р. Мельников, Т. Ю. Карогодина, С. Б. Зикирин, Д. В. Стась, академик РАН Ю. Н. Молин, академик РАН И. И. Гительзон
Поступило 18.07.2014 г.
БО1: 10.7868/80869565215040222
В настоящее время люминесцентные системы и механизмы свечения многих живых организмов хорошо изучены: из этих организмов выделены и охарактеризованы ферменты (люциферазы), катализирующие реакции излучения света, и их субстраты (люциферины) [1]. Однако для светящихся высших грибов эта задача остается пока нерешенной, и молекулярная организация их люминесцентной системы до сих пор остается малопонятной. Прежде всего, остается неясным, какой фермент (или ферментный комплекс) выполняет в грибах функцию люциферазы и какова структура субстрата реакции излучения — люци-ферина. В начале 90-х годов прошлого века была высказана идея, что в механизм грибной люминесценции вовлечены активные формы кислорода (АФК) и ферменты с оксидазной функцией [1, 2].
Результаты наших недавних исследований светящегося гриба ^опоЛорапш пашЫ также указывают на участие АФК и оксидазных ферментов в механизме его свечения и свидетельствуют о взаимосвязи грибной люминесцентной системы с мембранными структурами [3—5]. Совокупность этих данных позволила сделать предположение, что в реакции светоизлучения могут участвовать следующие ферментные системы, ас-
Институт биофизики
Сибирского отделения Российской Академии наук, Красноярск
Сибирский федеральный университет, Красноярск Специальное конструкторско-технологическое бюро "Наука"Красноярского научного центра Сибирского отделения Российской Академии наук, Красноярск
Институт химической кинетики и горения им. В.В. Воеводского
Сибирского отделения Российской Академии наук, Новосибирск
Новосибирский государственный университет
социированные с мембранами: оксидазы (в частности, пероксидазы) лигнинразрушающего комплекса, система цитохрома Р-450, ферменты дыхательной цепи митохондрий. Эти ферментные системы могут продуцировать АФК, а две из них (оксидазы лигнинолитического комплекса и система цитохрома Р-450) — катализировать окисление органических субстратов (включая люци-ферин) с участием АФК.
Таким образом, изучение взаимосвязи между образованием и трансформацией активных радикалов кислорода и люминесценцией высших грибов имеет важное значение для понимания механизмов свечения. Хорошо известно [6, 7], что стимулировать образование АФК в биологических объектах можно воздействием физических, химических и биологических факторов. В частности, показана активация образования АФК под действием ионизирующего излучения и, как следствие, стимуляция сверхслабой хеми-люминесценции растительных и животных клеток [8, 9]. В то же время в доступной литературе мы не нашли аналогичных работ по стимуляции люминесценции светящихся грибов.
В настоящей работе мы исследовали влияние ионизирующего излучения на люминесценцию гриба N. nambi.
Для экспериментов использовали мицелий гриба N. nambi, обитающего в тропических лесах Южного Вьетнама [10]. Культуру гриба для исследований любезно предоставила вьетнамская исследовательница Dao Thi Van (частная коллекция штаммов компании "BIO-LUMI Co., Ltd.", Вьетнам). Образцы светящегося мицелия в виде пленок и глобул получали с помощью разработанных нами технологий стационарного и глубинного культивирования гриба [3, 5]. Выращенный мицелий для удаления компонентов питательной среды и экзометаболитов, которые могут ингиби-ровать свечение, отмывали деионизированной водой (ДВ), полученной с помощью Milli-Q system ("Millipore", США). Для этого пленочный
Люминесценция, отн. ед.
Время, ч
Рис. 1. Типичная кинетика люминесценции образцов
мицелия N. патЫ, помещенных в измерительную кювету регистрирующего прибора.
мицелий инкубировали в ДВ в течение 12—14 ч. Глобулярный мицелий также помещали в ДВ и барботировали воздухом в течение такого же периода времени. Ранее было показано [4, 5], что отмывка водой приводит к значительному повышению люминесценции мицелия N. патЫ.
Эффект ионизирующего излучения на интенсивность и спектры световой эмиссии мицелия оценивали с помощью разработанного нами прибора, конструкция которого подробно изложена в работе [11]. Прибор включает рентгеновскую трубку для стационарного облучения изучаемого объекта и фотодетектор (ФЭУ) с системой линз и решеточным монохроматором. Это позволяет осуществлять регистрацию интенсивности световой эмиссии и запись спектра люминесценции объекта до, во время и после его облучения.
Образец (несколько глобул или вырезанный фрагмент пленочного мицелия размером 5 х 5 мм) помещали в кювету из полистирола диаметром 8 мм и высотой 8 мм, содержащую ДВ. Кювету устанавливали в прибор и регистрировали интенсивность и спектр люминесценции мицелия. В процессе регистрации образец в течение разных промежутков времени облучали полным спектром тормозного излучения при ускоряющем напряжении 40 кВ и оцениваемой мощности дозы 85 крад/ч. Детекцию люминесцентного сигнала осуществляли в направлении, перпендикулярном направлению падающего пучка рентгеновского излучения. Коррекцию спектра на кривую спектральной чувствительности ФЭУ не проводили.
Г—----- I I _I_I —^
200 300 400 500 600 700
Длина волны, нм
Рис. 2. Спектры световой эмиссии образцов мицелия N. nambi. 1 — контрольный образец (без облучения), 2 — опытный образец (при постоянном рентгеновском облучении). Стрелкой показана полоса (^max = = 325 нм) радиационно-индуцированной флуоресценции измерительной кюветы, изготовленной из полистирола.
Показано, что люминесцентные сигналы, регистрируемые от помещенных в измерительную кювету образцов мицелия N. nambi, имеют однотипную кинетику (рис. 1). Различия состоят только в интенсивности световой эмиссии разных образцов мицелия. Сначала отмечается повышенный уровень свечения, после чего наблюдается его затухание с выходом на стационарный уровень, который сохраняется в течение длительного (часы) времени (рис. 1). Повышенный уровень люминесценции, регистрируемый в начальный момент времени, можно объяснить механическим воздействием на гриб при подготовке образцов мицелия и их переносе в измерительную кювету. Снижение свечения до стационарного уровня у глобул мицелия составляет меньший период времени (от нескольких до десятков минут) по сравнению с фрагментами пленочного мицелия (несколько часов). Очевидно, это может быть связано с тем, что на стадии подготовки образцов пленочного мицелия гриб подвергается гораздо большему механическому воздействию (травме) и для его восстановления (релаксации) требуется большее время.
В экспериментах показано, что рентгеновское облучение не приводит к изменению спектра световой эмиссии гриба N. nambi. Как видно из представленных данных (рис. 2), спектры люминесценции контрольных (без облучения) и опытных (при постоянном воздействии рентгеновского излучения) образцов мицелия полностью совпадают и имеют максимум при 525 нм. Наличие в опытных пробах дополнительной полосы с мак-
470
БОНДАРЬ и др.
Люминесценция, отн. ед.
Время, ч
Рис. 3. Кинетика люминесценции мицелия N. патЫ при длительном (2—3 ч) воздействии радиационного излучения. Стрелками показаны моменты включения (1) и выключения (2) рентгеновского облучения.
симумом при 325 нм (рис. 2) опосредовано радиа-ционно-индуцированной флуоресценцией материала (полистирол), из которого изготовлена измерительная кювета. Показано, что аналогичная полоса с максимумом при 325 нм регистрируется при использовании пустой кюветы.
В наших исследованиях установлено, что длительное (2—3 ч) рентгеновское облучение стимулирует люминесценцию гриба N. патЫ (рис. 3). Из представленных данных видно, что при радиационном воздействии на мицелий через интервал времени, составляющий около 20 мин, наблюдается увеличение интенсивности его световой эмиссии. Повышение уровня свечения имеет медленную кинетику: время выхода люминесцентного сигнала на максимум составляет часы. Максимальные значения световой эмиссии мицелия, стимулированной воздействием радиационного излучения, могут превышать исходный уровень его свечения в 5—7 раз и более (рис. 3). Радиационно-активированная люминесценция имеет медленную (часы) кинетику затухания. Показано, что эта стадия не является чувствительной к рентгеновскому излучению, поскольку его отключение не меняет кинетику снижения люминесцентного сигнала (рис. 3). Из данных рисунка видно, что после снижения люминесценции до некоторого уровня наблюдаются существенные изменения в кинетике свечения мицелия. Регистрируется значительное снижение его световой эмиссии в течение относительно короткого (около 30 мин) периода времени. После этого мице-
Люминесценция, отн. ед.
Время, ч
Рис. 4. Кинетика люминесценции мицелия N. nambi при многоразовом кратковременном (по 10 мин) воздействии радиационного излучения. Стрелками показаны моменты включения рентгеновского облучения.
лий полностью утрачивает способность светиться: величина регистрируемых сигналов совпадает с фоновым уровнем шума измерительной системы. Наблюдаемый эффект рентгеновского облучения является типичным для данного вида гриба. Аналогичные радиационно-индуцированные изменения световой эмиссии были зафиксированы на разных образцах (глобулы, пленки) мицелия N. nambi, полученных при периодическом культивировании гриба на протяжении полугода.
В следующей серии экспериментов было показано (рис. 4), что при фиксированной мощности облучения сокращение времени рентгеновского воздействия на мицелий N. nambi сопровождается меньшим стимулирующим эффектом его люминесценции. Как видно из представленных данных, короткие сеансы облучения мицелия не сопровождаются утратой его свечения. Более того, периодическое кратковременное (по 10 мин) облучение мицелия на фоне затухания его радиаци-онно-активированной люминесценции п
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.