== РАДИАЦИОННАЯ БИОХИМИЯ =
УДК [57+61]::539.1.04:599.323.4:611.018.13
ВЛИЯНИЕ ИОНИЗИРУЮЩЕЙ РАДИАЦИИ НА ФЕРМЕНТНЫЕ АКТИВНОСТИ И СОСТОЯНИЕ ЯДЕРНО-ЯДРЫШКОВОГО АППАРАТА
ГЕПАТОЦИТОВ КРЫС
© 2013 г. Л. С. Нерсесова*, М. Г. Газарянц, З. С. Мкртчян, Г. О. Меликсетян, Л. Г. Погосян, С. А. Погосян, Л. Л. Погосян, Е. М. Каралова, А. С. Аветисян, Л. О. Аброян, З. А. Каралян, Ж. И. Акопян
Институт молекулярной биологии НАН РА, Ереван, Республика Армения
Изучено влияние однократного тотального облучения в дозах 3.5 и 4.5 Гр на креатинкиназную, пу-риннуклеозидфосфорилазную, аланинаминотрансферазную, аспартатаминотрансферазную активности эстракта печени и сыворотки крови, а также на состояние ядерно-ядрышкового аппарата ге-патоцитов у крыс на 6-е и 13-е сут после облучения. Показано, что эти ферментные показатели обладают различными радиочувствительностью и адаптационными возможностями, о чем свидетельствуют разнонаправленные изменения их уровней в одни и те же сроки исследования и колебательные изменения во времени. Изменения ферментной активности в большой степени соответствуют изменениям морфометрических показателей ядерно-ядрышкового аппарата гепатоци-тов: в частности, распределению ядер по плоидности. Стабилизация ферментных активностей на 13-е сут после облучения совпадает с повышением транскрипционной активности ядерной ДНК клеток, выражавшемся в виде значительного возрастания количества ядрышек на ядро и увеличения площади контура гепатоцитов. При этом компенсаторные механизмы направлены, вероятно, не на замещение погибших клеток новыми, а на повышение функциональной активности выживших гепатоцитов.
Острое облучение, гепатоциты, сыворотка крови, аланинаминотрансферазная, аспартатамино-трансферазная, креатинкиназная и пуриннуклеозидфосфорилазная активности, ядерно-ядрышковый аппарат гепатоцитов.
БОТ: 10.7868/80869803113010098
Известно, что ионизирующее излучение (ИИ) оказывает на клетки как прямое действие, вызывая разрывы химических связей в макромолекулах, в том числе в ДНК и ферментных белках, так и опосредованное, свободнорадикальное действие, обусловленное образованием радиолити-ческих продуктов воды и кислорода, которые агрессивно взаимодействуют с макромолекулами [1]. В результате этого имеют место изменения как в уровнях активности, так и в биосинтезе ферментов, что служит основанием для использования анализа ферментной активности для оценки влияния ионизирующего излучения на организм и изучения эффективности различных радиопротекторов [1—5]. Ранее нами было исследовано влияние рентгеновского излучения на активность ряда ключевых ферментов клеточного метаболизма различных органов крыс [5]: наиболее радиочувствительными оказались сывороточные ферментные активности креатинкиназы (КК) — клю-
* Адресат для корреспонденции: Республика Армения, 0014 Ереван, ул. Асратяна, 7, Институт молекулярной биологии НАН РА; тел.: (37410) 28-75-06, (37410) 28-16-26; факс: (37410) 28-21-60; e-mail: l.nersesova@yahoo.com.
чевого фермента энергетического обмена клетки и пуриннуклеозидфосфорилазы (ПНФ) — фермента обмена пуриновых оснований, являющегося маркером иммунодефицитных состояний организма. Несколько меньшую радиочувствительность показали ПНФ головного мозга и КК печени и селезенки. Наряду с этим мы обнаружили дозозависимые разнонаправленные изменения активностей сывороточных щелочной фос-фатазы, аланин- и аспартатаминотрансфераз (АЛТ и АСТ), характеризующих функциональную активность печени.
Исходя из того, что ядерно-ядрышковый аппарат является первичной мишенью радиационного поражения и ультраструктурные изменения в гепатоцитах приводят к функциональному дисбалансу их, в настоящей работе исследована взаимосвязь индуцированных действием ИИ изменений КК-, АЛТ-, АСТ- и ПНФ-ных активностей печени и сыворотки крови крыс и структуры и функций ядерно-ядрышкового аппарата гепатоцитов в динамике после облучения. В связи с последним следует отметить, что одними из показателей функциональных изменений, происходя-
щих в клетках при действии различных стрессорных факторов, являются изменения содержания ДНК и состояния ее ядрышкового аппарата [6, 7], которые могут объективно отражать степень напряженности рибосомального синтеза и пролиферативной активности гепато-цитов [8-10].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
Опыты проведены на 36 белых беспородных крысах-самцах весом 160-180 г, содержавшихся на стандартном рационе питания. Животные, с равноценным распределением по массе тела и числу особей в группах (n = 6), были подвергнуты однократному общему облучению на рентгеновской установке "РУМ-17" в сублетальных дозах 3.5 и 4.5 Гр (мощность дозы — 1.78 Гр/мин, напряжение — 200 кВ, сила тока — 20 мА, фокусное расстояние — 50 см, без фильтров; при этих условиях значение дозы 50%-ной выживаемости за 30 сут (ЛД 50/30) составляет 6.5 Гр) и исследованы через 6 и 13 сут после лучевого воздействия. В качестве контроля были использованы соответствующие группы интактных животных. Декапитацию животных (работа одобрена Биоэтическим комитетом Института молекулярной биологии НАН РА) проводили после эфирного наркоза. Кровь собирали в пробирки без антикоагулянта, после ее свертывания центрифугировали в рефрижераторной центрифуге при 800 g в течение 20 мин и полученную сыворотку крови использовали в тот же день для определения ферментной активности. Печень отмывали от крови охлажденным физиологическим раствором и гомогенизировали в экстрагирующем буферном растворе с рН 7.2 (0.1 моль/л трис-НС1, 5 ммоль/л дитиотреитола (ДТТ) и 1 ммоль/л этилендиаминтетраацетата (ЭДТА)). Экстракты, полученные после центрифугирования гомогенатов при 25300 g в течение 30 мин, использовали для определения ферментной активности.
Активность КК-ную определяли спектрофо-тометрически по накоплению продукта реакции креатина [11], ПНФ-ную — по накоплению продукта реакции гуанина [12], а АЛТ-ную и АСТ-ную — на основе измерения убыли восстановленного никотинамидадениндинуклеотида (НАДН) в сопряженных реакциях с лактатдегид-рогеназой и малатдегидрогеназой, соответственно [13]. Ферментную активность выражали в мкмоль/г влажной ткани в мин для тканей и мкмоль/л • мин для сыворотки.
Для определения изменений содержания ДНК в ядрах гепатоцитов на предметных стеклах готовили отпечатки ядер, которые затем фиксировали в 96% этиловом спирте в течение 30 мин [14]. Препараты окрашивали по общепринятой методике реактивом Шиффа по Фельгену: гидролиз в
5 н HCl в течение 60 мин при 22°С [15, 16]. Определение количества ДНК в условно сравнимых единицах при длине волны 575 нм и цитоморфо-метрию ядер проводили телевизионным методом на сканирующем анализаторе изображений (увеличение 100 х 1.30), созданном на базе микроскопа-фотометра "SMP 05" ("OPTON", ФРГ), оснащенном компьютером. В связи с этим перед сканированием оконтуривали изображения ядер и каждого из ядрышек в тех клетках, где они выявлялись. Измерения в каждом случае производили в 100 ядрах. В качестве диплоидного эталона ДНК использовали лимфоциты периферической крови здоровых крыс. На основании данных по содержанию ДНК в гепатоцитах крыс соотнесенных к эталону выявляли распределение гепатоцитов по плоидности (в %) и определяли соотношение эу- и анэуплоидных клеток. Значения исследованных параметров выражали в условных единицах [15, 16].
Для статистической обработки данных использован пакет SPSS (Statistical Package for Social Science). Характер распределения полученных данных определен методом Колмогорова-Смирнова. Сравнительный анализ проведен с использованием непараметрического теста Манна-Уит-ни. Различия считались достоверными при р < 0.05. Корреляционный анализ проведен с использованием непараметрического теста Спир-мена.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Исследовано влияние облучения в сублетальных дозах 3.5 и 4.5 Гр на КК-, ПНФ-, АСТ- и АЛТ-ные активности супернатанта гомогенатов печени и сыворотки крови крыс и на изменения морфологии ядерно-ядрышкового аппарата гепатоцитов этих животных на 6-е и 13-е сут после облучения путем двукратного повторения опытов. В каждой из двух серий экспериментов, соответствующих указанным двум дозам облучения, в качестве контроля были использованы соответствующие группы интактных животных, подвергнутых ложному облучению (т.е. подвергнутых влиянию всех сопровождавших облучение процедур, но не подвергавшихся воздействию ионизирующей радиации).
Как видно из рис. 1, а, при дозе облучения в 3.5 Гр через 6 сут в печени наблюдается достоверное понижение уровней КК- и АЛТ-ной активностей и повышение уровня ПНФ-ной активности, а также тенденция к повышению уровня АСТ-ной активности. Понижение примерно на 50% уровня КК-ной активности в печени обратно коррелирует (r = -0.718,р < 0.001) со сравнимым по величине возрастанием уровня той же ферментной активности в сыворотке крови. Что касается резкого падения уровня сывороточной ПНФ-ной
350
300
250
д"
т с о 200
н в 150
и
т Акт А 100
50
0
*
1*Т
¿X,
□ -печень *
□ -сыворотка крови *
I ;
160 140
^ 120 g 100
я 80
тив 60 Акт 40 20 0
□ - печень
□ - сыворотка крови £
L 1
I
1 2 3 4 1 2 3 4
2 3
12 3
Рис. 1. Изменения уровней КК- (1), АЛТ- (2), АСТ-(3), ПНФ-ной (4) активностей в печени и сыворотке крови крыс на 6-е и 13-е сут после облучения в дозе 3.5 Гр: а — 3.5 Гр/6 сут (п = 6), б — 3.5 Гр/13 сут (п = 6). * Отличие от контроля достоверно — р < 0.05—0.001.
Рис. 2. Изменения уровней КК- (1), АЛТ- (2), АСТ-(3), ПНФ-ной (4) активностей в печени и сыворотке крови крыс на 6-е и 13-е сут после облучения в дозе 4.5 Гр: а — 4.5 Гр/6 сут (п = 6), б — 4.5 Гр/13 сут. * Отличие от контроля достоверно — р < 0.05-0.001.
активности в этой серии экспериментов (рис. 1, а), оно, вероятно, обусловлено пострадиационной гибелью клеток крови, характеризующихся высокой ПНФ-ной активностью [12]. В отличие от КК-ной активности, падение на 40% уровня печеночной АЛТ-ной активности (рис. 1, а), которая как и цитоплазматическая КК-ная считается клиническим маркером нарушения целостности клетки [13], сопровождается не повышением, а достоверным падением уровня активности ее в сыворотке кр
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.