БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2007, том 24, № 5, с. 413-420
УДК 5763855:576314
ВЛИЯНИЕ ИОНИЗИРУЮЩЕЙ РАДИАЦИИ НА МНОЖЕСТВЕННУЮ ЛЕКАРСТВЕННУЮ УСТОЙЧИВОСТЬ КЛЕТОК РАКА ГОРТАНИ ЧЕЛОВЕКА НЕр-2
© 2007 г. В. В. Шапошникова, А. Ф. Корыстова, М. О. Емельянов, Л. Н. Кублик, А. А. Кудрявцев, М. X. Левитман, Ю. А. Ким*, Ю. Н. Корыстов
Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290, Пущино Московской области;
электронная почта: ykorystov@rambler.ru; *Институт биофизики клетки РАН, 142290, Пущино Московской области Поступила в редакцию 19.02.2007 г.
Исследовали влияние ионизирующей радиации на множественную лекарственную устойчивость клеток НЕр-2. Множественную лекарственную устойчивость определяли по увеличению чувствительности клеток к даунорубицину, таксолу и винкристину под действием ингибиторов множественной лекарственной устойчивости циклоспорина А и авермектина Вх, а также по подавлению циклоспорином А транспорта родамина 123 из клеток. Показано, что через 8 и 16 ч после облучения в дозе до 4 Гр множественная лекарственная устойчивость клеток увеличивается, а через 24 ч возвращается к контрольному уровню. Максимальный эффект наблюдается через 16 ч после облучения в дозе 1 Гр. Увеличивается как скорость транспорта родамина 123 из клеток, так и их устойчивость к винкристину. Эффект облучения на множественную лекарственную устойчивость клеток НЕр-2 зависит от плотности клеток на подложке и достигает максимума при плотности 80-100 тысяч на см2. Предполагается, что зависимость множественной лекарственной устойчивости клеток НЕр-2 от дозы облучения и плотности клеток может быть обусловлена изменением количества активных форм кислорода в клетках.
Множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) опухолевых клеток, обусловленная синтезом в них транспортных белков, откачивающих из клеток противоопухолевые средства, является одним из основных факторов, препятствующих успешной химиотерапии опухолей. В случае опухолей с МЛУ целесообразным может быть применение других методов, в частности радиотерапии, а также сочетания радио- и химиотерапии. Для эффективного совместного применения облучения и противоопухолевых средств необходима информация о влиянии радиации на МЛУ опухолей. В настоящее время нам известны две работы [1, 2], в которых изучено влияние облучения на экспрессию в клетках глиомы человека транспортного белка ABC-1 [1] и экспрессию в клетках лейкоза человека мРНК гена MRP (multidrug resistance protein) [2] и показано увеличение экспрессии после облучения. Опубликованы также работы, косвенным образом свидетельствующие о том, что радиация может влиять на МЛУ опухолевых клеток, обусловленную синтезом в них транспортных белков. Синтез и активность этих белков регулируются окислительным стрессом [3, 4], зависят от про-теинкиназы С [5-7] и факторов транскрипции NF-kB и c-Jun [5, 6, 8, 9]. Известно также, что под действием ионизирующей радиации в клетках увеличивается количество активных форм кислорода (окислительный стресс) [10], факторов транскрип-
ции [11-13] и повышается активность протеинки-назы С [14, 15].
В перечисленных работах обнаружено увеличение содержания транспортных белков и количества их мРНк, но активность этих белков по выведению из клеток их субстратов и устойчивость клеток к токсическим агентам после облучения не изучалась. В настоящей работе исследовали влияние радиации на скорость удаления из клеток рака гортани человека НЕр-2 субстрата транспортных белков родамина 123 и на устойчивость клеток к винкристину.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Выживаемость клеток модифицировали противоопухолевыми средствами: винкристином ("Gede-on Richter", Венгрия), даунорубицином ("Sigma", США), таксолом ("Sigma"), а также ингибиторами транспортных белков - циклоспорином А ("Sigma") и авермектином В1 ("Фармбиомед", Россия). Даунорубицин растворяли в растворе Хэнкса, вин-кристин - в физиологическом растворе с добавкой 0.9% бензилового спирта, все остальные соединения растворяли в этаноле. Этанол в максимальной используемой концентрации 0.1% не влиял на выживаемость клеток: она составляла 103 ± 3%.
Клетки рака гортани человека НБр-2 в среде DMEM ("Sigma"), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки ("Sigma") и 40 мкг/мл ген-тамицина ("Sigma"), рассевали в 96-луночный планшет ("ICN", США) - по 0.1 мл при концентрации 100 тысяч/мл. Клетки инкубировали 1 сут при 37°С в атмосфере 5 % С02, затем добавляли исследуемые соединения и инкубировали еще 2 сут. При определении влияния радиации на МЛУ клеток по критерию выживаемости, высевали больше клеток на ячейку - 14 тысяч, поскольку эффект облучения зависит от концентрации клеток на подложке (см. Результаты и их обсуждение). При изучении влияния облучения в дозе 1 Гр клетки облучали вечером и на следующее утро (через 16 ч) обрабатывали винкристином в течение 30 мин при 37°С. Облучение проводили на рентгеновской установке "РУТ-250-15-1" при мощности дозы 1.12 Гр/мин, напряженности 200 кВ, силе тока 20 мА, фильтры 1 мм Al и 1 мм Cu, фокусное расстояние 37 см, при комнатной температуре. После этого клетки инкубировали 2 сут при 37°С в атмосфере 5% С02, затем окрашивали 0.02% фиолетовым кристаллическим ("Sigma") в 20% этаноле в течение 10 мин. Раствор красителя удаляли, промывали ячейки водой и добавляли 0.1% раствор доде-цилсульфата натрия для удаления красителя из клеток. Оптическую плотность определяли при 570 нм на спектрофотометре Multiscan Plus. Оптическая плотность увеличивалась линейно при увеличении количества клеток в ячейке в интервале 1-30 тысяч клеток. Эффект воздействия определяли по формуле: No/Nk = (Do - D)/(Dk - D)100%, где Do, Dk, D - оптическая плотность в опыте, контроле и фоновая (среда с сывороткой без клеток) соответственно, а No/Nk - выживаемость клеток, т.е. количество живых клеток в опыте по отношению к контролю.
Распределение клеток по содержанию ДНК определяли с помощью проточного цитометра ("Partee", Германия). Клетки фиксировали 70% этанолом, переносили в фосфатный буфер (рН 7.2) и окрашивали красителем Hoechst 33258 ("Serva", Германия, 2 мкг/мл, 5 мин). Флуоресценцию возбуждали излучением с X = 450 нм. Гистограммы распределения клеток по содержанию ДНК строили по результатам измерения 20-50 тысяч клеток.
Активность транспортных белков, обеспечивающих МЛУ в клетках, определяли по скорости выхода из клеток родамина 123 ("ICN") [16, 17]. Клетки высевали в среде DMEM, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки и гентамицин (40 мкг/мл), в пластиковые флаконы (25 мл, объем среды 6 мл). Перед посевом клеток флакон ставили на узкую сторону и помещали в него две стеклянные пластинки (50 х 9 мм) толщиной 2 мм. Плотность посеянных клеток на пластинках варьировала от 20 до 300 тысяч на см2. Клетки облучали на рентгеновской установке за 16 ч до опреде-
ления скорости транспорта родамина 123. Клетки инкубировали в С02-инкубаторе при 37°С в течение 1 сут, отмывали в среде RPMI 1640 ("Sigma") и нагружали их родамином 123 (0.5 мкг/мл, 1.3 мкМ) в среде RPMI 1640, содержащей 5% эмбриональной сыворотки, в течение 60 мин при 37°C. После инкубации клетки трижды (по 10 мин) отмывали от красителя холодным (2°С) раствором Хэнкса ("Sigma") с 1% эмбриональной сывороткой. После отмывки и до момента измерения пластинки с клетками хранили в растворе Хэнкса с 0.5% сыворотки на льду. Отмытую пластинку с клетками ставили в кювету спектрофотометра MF44 Perkin-Elmer с раствором Хэнкса, содержащим 0.5% эмбриональной сыворотки (объем 3 мл, 37°C), и определяли увеличение количества родамина 123 в среде при постоянном перемешивании с интервалом 2 с. Длины волн возбуждения и эмиссии - 488 и 520 нм соответственно. Для определения коэффициента ингибирования активного транспорта родамина 123, характеризующего МЛУ [16], в кювету через несколько (5-6) минут нормального выхода красителя добавляли ингибитор транспортных белков циклоспорин А (0.3-1 мкг/мл, 0.24-0.8 мкМ). В конце эксперимента для определения суммарного содержания родамина 123 в клетках в кювету добавляли 0.02% дигитонина ("Sigma"), что приводило к увеличению проницаемости и быстрому выходу родамина 123 в среду. Определение констант скоростей выхода родамина для клеток в контроле и при действии ингибитора на одной пластинке уменьшает ошибку определения их отношения, необходимого для получения коэффициента ингибирования (R).
Поскольку в работе было обнаружено, что влияние облучения на транспорт родамина 123 из клеток зависит от плотности клеток на пластинке, то необходимо было изучить эту зависимость и в контроле. Теоретически этот вопрос рассмотрен в работе [16]. Показано, что родамин 123 выходит из клеток по экспоненциальному закону с показателем 1/т = {к + (Vmax/KM)}/Vn, где к - константа пассивного выхода родамина 123 из клеток, а Vmax/KM -характеристика активного транспорта, Vmax - максимальная скорость активного транспорта, KM -константа Михаэлиса, Vin - объем всех клеток. Показано также, что отношение скоростей выхода родамина 123 из клеток в норме и при полном подавлении активного транспорта минус 1 : (R - 1)max равно отношению активного и пассивного транспорта и, следовательно, характеризует активность в клетках белков, обеспечивающих МЛУ. Экспериментально определяется 1/т. Обозначим ее как к. В случае активного транспорта родамина 123 из клеток, где он находится в одном компартменте, к = (к + Vmax/KM)/Vn, а если в двух компартментах (в цитоплазме и митохондриях), то к = (Vmax/KM + к + + кУ nJV0)/Vim где Vo - объем среды. В обоих случа-
d
Рис. 1. Зависимость константы скорости выхода родамина 123 из клеток НЕр-2 (к') от количества родамина 123 в клетках (d). N = 7.
ях, если родамин находится в клетках в одном компартменте, то к должно уменьшаться при увеличении Vin пропорционально количеству родамина 123 (в относительных единицах флуоресценции) во всех клетках на пластинке (d). Такая зависимость получается и по нашим данным (рис. 1). В случае определения к и к, (константа скорости выхода родамина 123 в присутствии ингибитора) на одном стекле (одинаковое Vin) величина R, равная
отношению к/к' не завис
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.