УДК 581.19
ВЛИЯНИЕ ИОНОВ Cu2+ И Cd2+ НА МЕТАБОЛИЗМ МЕМБРАННЫХ ЛИПИДОВ И БЕЛКОВ Hydrilla verticillata
© 2012 г. О. А. Розенцвет1, В. Н. Нестеров1*, Н. Ф. Синютина2, О. В. Танкелюн2
Институт экологии Волжского бассейна РАН, 445003, Тольятти, ул. Комзина, 10; *электронная почта: nesvik1@mail.ru 2Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7-9
Поступила в редакцию 16.10.2011 г.
Изучено влияние ионов Cu2+ и Cd2+ (1, 3, 24 ч) в концентрации 100 мкМ на содержание и метаболизм липидов и белков в мембранах хлоропластов, митохондрий и микросом водного растения Hydrilla verticillata (L. fil.) Royle. Показано, что присутствие ионов металлов в среде инкубации приводит к значительному снижению содержания суммарных фосфолипидов (в большей степени в мембранах хлоропластов и микросом), а также фосфатидилхолина и фосфатидилэтаноламина. В экспериментах по включению [14С—СН3]метионина при синтезе PtdCho установлено, что под действием ионов Cu2+ и Cd2+ происходит не только деструкция липидов, но и их интенсивное обновление за счет включения альтернативного пути биосинтеза — трансметилирования. Показано также усиление включения [14С—СН3]метионина в мембранные белки. Обсуждаются механизмы регуляции метаболизма липидов, связанные с увеличением содержания фосфатидной кислоты (PtdA) и скорости обмена липидов и белков.
Ключевые слова: Hydrilla verticillata, субклеточные мембраны, липиды, белки, медь, кадмий.
Интерес к изучению роли клеточных мембран в поддержании адаптационной взаимосвязи клетки и внешней среды не ослабевает и остается актуальным в связи с увеличением техногенной нагрузки на природные экосистемы [1—3]. Значительное увеличение содержания в окружающей среде тяжелых металлов — одного из наиболее опасных и широко распространенных видов загрязнений — сопровождается накоплением тяжелых металлов в растениях и поступлением по пищевым цепям в организм человека [4—9]. Анализ данных об устойчивости растений к воздействию тяжелых металлов показывает, что физиологическая толерантность растительных клеток, их способность приспосабливаться к действию повреждающего фактора в значительной степени связаны с изменениями состава и соотношения липидов [10—15].
Влияние тяжелых металлов на фосфолипиды как структурную основу мембран вызывает особый интерес. Показано, что под действием тяжелых металлов изменяется количественный состав фосфолипидов растений в результате изменения путей их биосинтеза, уменьшения ненасыщенности жирных кислот, связанной с перекисным
Сокращения: PtdCho — фосфатидилхолин; PtdEtn — фосфа-тидилэтаноламин; PtdA — фосфатидная кислота; SAM — S-аденозилметионин; PtdGly — фосфатидилглицерин; DAG — диацилглицерин; CydP-Cho — цитидинфосфохолин; P-Etn — фосфоэтаноламин; P-Cho — фосфохолин.
окислением [10]. Характер изменений состава ли-пидов существенно зависит от видовых особенностей организма, типа тканей и органов, а также от металла и его концентрации [14]. Меньше известно о вкладе отдельных субклеточных мембранных систем в изменение суммарного состава фосфолипидов клеток под действием тяжелых металлов.
Фосфатидилхолин (Р1ёСИо) и фосфатидилэта-ноламин ^ёЕШ) входят в число наиболее распространенных фосфолипидов эукариотических клеток [16]. Они являются главными ацильными липидами непластидных мембран растений [17], в отличие от фосфатидилглицерина (Р1ёС1у) — основного фосфорсодержащего липида мембран тилакоидов [18]. Р1ёСИо играет важную структурную роль и выполняет ряд метаболических функций. В частности, Р1ёСИо служит субстратом для нескольких десатураз жирных кислот [18], он является предшественником таких сигнальных молекул, как фосфатидная кислота (Р1ёЛ) и свободные жирные кислоты [19, 20]. Окисление холино-вой группы Р1ёСИо во многих видах растений приводит к образованию глицинбетаина — сильнодействующего осмопротектора [21].
Известно, что в клетках эукариот Р1ёСИо синтезируется двумя различными путями. Первый — так называемый "нуклеотидный путь", или путь Кеннеди, который включает присоединение ци-тидиндифосфохолина (СуёР-СИо) к диацилгли-
CydP-Etn
PtdEtn
PtdA
DAG
I
SAM SAH
CydP-Ch^ PtdCho
SAM SAH
SAM SAH
PtdEtn -- PtdME -- PtdDE -- PtdCho II
Etn
Cho
- P-Etn -
I
P-MMEtn
I
P-DMEtn
I
■ P-Cho -
CydP-Etn
PtdEtn
CydP-MMEtn —► PtdMEtn III
I
CydP-DMEtn —PtdDEtn 1
CydP-Cho —» PtdCho
Рис. 1. Схемы биосинтеза фосфатидилхолина (PtdCho) у эукариот: I — нуклеотидный путь; II — "трансметилирование"; III — альтернативный синтез PtdCho в растительных клетках. CydP-Cho — цитидиндифосфохолин, CydP-Etn — цитидиндифосфоэтаноламин; CydP-DMEtn — цитидиндифосфодиметилэтаноламин; CydP-MMEtn — цитидинди-фосфомонометилэтаноламин; Cho — холин; DAG — диацилглицерин; Etn — этаноламин; PtdA — фосфатидная кислота; P-Cho — фосфохолин; P-DMEtn — фосфодиметилэтаноламин; P-Etn — фосфоэтаноламин; P-MMEtn — фосфомо-нометилэтаноламин; PtdEtn — фосфатидилэтаноламин; PtdMEtn — фосфатидилмонометилэтаноламин; PtdDMEtn — фосфатидилдиметилэтаноламин; SAM — S-аденозилметионин.
церину (DAG), получаемому из PtdA (рис. 1, I). Второй путь назван трансметилированием. Согласно этому пути PtdCho образуется непосредственно из PtdEth последовательным трехступенчатым метилированием аминогруппы. Донором метильной группы здесь служит S-аденозилмети-онин (SAM) (рис. 1, II) [22].
В растениях обнаружены альтернативные пути превращения полярной группы PtdEth. Впервые об этом сообщили Datko и Mudd [22], показав, что в растениях Lemna pauciocostata свободный фосфоэтаноламин (P-Etn) сначала полностью превращается в фосфохолин (P-Cho), с последующим образованием PtdCho. В культуре клеток сои P-Etn подвергается метилированию с образованием фосфомонометилэтаноламина (P-MMEtn), который превращается в фосфатидилмонометил-этаноламин (PtdMEtn), далее из фосфатидилди-метилэтаноламина (PtdDMEtn) синтезируется PtdCho. В культурах клеток моркови обнаружена комбинация этих двух путей. Показано [23], что в культуре клеток листьев оливы преобладал синтез PtdCho с участием двух первых реакций метилирования с образованием фосфодиметилэтанол-амина (P-DEtn), а в последнем метилировании субстратом служил PtdDEtn. Схема синтеза PtdCho у растений, признанная многими исследователями, показана на рис. 1, III [23, 24]. Можно
видеть, что альтернативный синтез PtdCho осуществляется в результате сочетания двух биосинтетических путей. Считают, что второй путь менее активен в растениях [25]. В то же время предполагается, что этот путь активируется в растениях в условиях стресса [23, 26].
Липиды являются структурной основой биологических мембран, и многие специфические мембранные функции зависят от липидного и белкового состава мембраны [27, 28].
Цель работы состояла в изучении регуляции метаболизма липидов и белков в составе субклеточных мембран растений Hydrilla verticillata (L. fil.) Royle, успешно применяемых для удаления тяжелых металлов из водных экосистем, под действием Cu2+ и Cd2+ [29].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Опыты проводили на растениях H. verticillata (гидрилла мутовчатая) семейства Hydrocharitace-ae (водокрасовые). Растения выращивали в лабораторных условиях на 5% среде Хогланда-Арно-на. Перед началом эксперимента побеги растений разрезали на фрагменты весом 4-5 г и помещали в вегетационные сосуды объемом 1 л c отстоянной водопроводной водой. В опытные варианты добавляли Cu(NO3)2 или Cd(NO3)2 в кон-
центрации 100 мкМ, выбранной исходя из ранее полученных концентрационных и временных зависимостей влияния тяжелых металлов на липид-ный, белковый и пигментный метаболизм водных растений [15]. Растения инкубировали в условиях освещения — 1400 ± 200 лк при 10 ч световом дне и температуре 20°С. По истечении заданного времени (1, 3 и 24 ч) растения промывали в проточной воде, переносили в чашки Петри и инкубировали в течение 40 мин в водном растворе [14С—СН3]метионина из расчета 40 мкКи в 60 мл инкубационной среды. Далее растения отмывали дистиллированной водой, гомогенизировали в охлажденной среде выделения (0.5 М сахарозы, 50 мМ трис-НС1, 5 мМ БЭТА, 5 мкМ р-меркаптоэтанола, рН 7.8), фильтровали через три слоя марли. Гомогенат центрифугировали в течение 10 мин при 500 % для получения фракции хлоропластов. Супернатант центрифугировали (15 мин при 15000 %) и получили в осадке мито-хондриальную фракцию. Из супернатанта центрифугированием (80000 1 ч) осаждали общую микросомальную фракцию. Осадки мембран ре-суспендировали в среде, содержащей 0.5 М сахарозы, 5 мМ трис-НС1, рН 7.2. Для определения белка отбирали 10% материала фракций, из остальной части извлекали мембранные липиды.
Липиды трижды экстрагировали смесью хлороформа и метанола (1 : 2, по объему) с одновременным механическим разрушением тканей со стеклянными бусами [30]. Объединенные экстракты отмывали от нелипидных примесей, растворитель отгоняли на роторно-вакуумном испарителе. Фосфолипиды очищали с помощью двумерной тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинках 6 х 6 см с закрепленным слоем сили-кагеля (Наар8а1и, Эстония) с использованием систем растворителей: первое направление — хлороформ : метанол : бензол : 28% аммиак (130 : 60 : 20 : 12 по объему); второе направление — хлороформ : : метанол : бензол : ацетон : уксусная кислота (140 : 60 : 20 : 10 : 8 по объему). Хроматограммы опрыскивали 10% серной кислотой в метаноле и нагревали при 180°С в течение 15 мин до проявления пятен. Количественное определение фосфоли-пидов проводили методом Васьковского и соавт. по содержанию неорганического фосфора [31].
Для определения включения радиоактивной метки фосфолипиды предварительно отделяли от других липидов с помощью ТСХ в системе гексан : : диэтиловый эфир : уксусная кислота (80 : 20 : 1, по объему), полярные липиды, включая фосфо- и гликолипиды, оставались на старте. Затем фракцию полярных липидов соскабливали с пластинок, липиды экстрагировали смесью хлороформ : : метанол (1 : 1 по объему), концентрировали на роторном испарителе и разделяли в системе хлороформ : метанол : 7 н. NН4ОН (65 : 25 : 4). Липиды проявляли в парах йода. Для идентификации
PtdCho использо
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.