^^^^^^^^^^^^ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ
СТАТЬИ
581.1
ВЛИЯНИЕ ИОНОВ МЕДИ НА УРОВЕНЬ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ ДВУХ КАЛЛУСНЫХ ЛИНИЙ
КУКУРУЗЫ РАЗНОГО ВОЗРАСТА © 2015 г. А. И. Соловьева, В. В. Гайсинский, Ю. И. Долгих
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Москва Поступила в редакцию 28.04.2014 г.
Исследовали вариабельность RAPD- и ISSR-маркеров в двух каллусных линиях кукурузы (Zea mays L., линии ARm15 и ARm22), каждая из которых была получена из одного зародыша, выращиваемых в стандартных условиях, а также на среде с ионами меди. Каллус линии ARm15 культивировали in vitro восемь месяцев, каллус линии ARm22 — два года. За это время каллусные линии стали генетически неоднородными: вариабельность фрагментов ДНК составила 13.3% у ARm15 и 15.0% у ARm22. Инкубация в стрессовых условиях на среде с ионами меди сопровождалась уменьшением доли полиморфных фрагментов ДНК. Только с одним праймером QR2 в ДНК линии ARm15, выращиваемой на среде с ионами меди, был обнаружен ампликон, не выявленный в исходной культуре. Характер изменений генома не зависел от концентрации меди в среде и возраста культивируемых клеток.
Ключевые слова: Zea mays — генетическая изменчивость — RAPD — ISSR — стресс — ионы меди
ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2015, том 62, № 1, с. 89-95
УДК
Б01: 10.7868/80015330315010145
ВВЕДЕНИЕ
Неблагоприятные условия окружающей среды негативно влияют на многие процессы жизнедеятельности растений. Под действием стрессовых факторов изменяются активность ферментов, поглощение и транспорт питательных веществ по растению, интенсивность фотосинтеза, дыхания, транспирации и др. Все это в итоге проявляется в замедлении роста растений, уменьшении их продуктивности и даже может приводить к гибели.
Если физиологические последствия стрессов активно исследуются, то действие неблагоприятных факторов на геном растений изучено еще недостаточно. Различные стрессовые факторы нарушают работу регуляторных и репарационных систем растений, индуцируют изменения экспрессии генов, вызывают структурную реорганизацию ДНК. Известны многочисленные факты изменения уровня метилирования оснований ДНК, метилирования и ацетилирования гисто-нов, амплификации и деамплификации отдельных участков ДНК, активации мобильных элементов [1]. Все это может служить косвенной
Адрес для корреспонденции: Долгих Юлия Ивановна. 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН. Факс: 007 (499) 977-80-18; электронная почта: gsc@ippras.ru
причиной мутаций. Однако прямых данных о возникновении генетической изменчивости под действием стрессов очень мало и нет количественной оценки влияния стрессов на геном растений.
Удобной моделью для изучения стресс-инду-цированной изменчивости является культура клеток in vitro, так как действие на нее стрессовых факторов не опосредовано регуляторными системами целого растения, возможно поддержание стандартных условий ее культивирования, нет зависимости от сезона. Проблема возникновения мутаций под действием стрессоров имеет для культивируемых in vitro клеток самостоятельное значение. На протяжении выращивания из-за сбоев оборудования культивируемые клетки могут подвергаться гипоксии, окислительному стрессу, колебаниям температуры. Поэтому в случае культур-продуцентов биологически активных веществ или при клональном микроразмножении, когда необходимо сохранение стабильности генома, очень важно заранее оценить степень риска появления мутаций при нарушении условий культивирования.
Культивируемые клетки можно рассматривать в двух аспектах. С одной стороны, сама изоляция и выращивание тканей in vitro является разновидностью стресса, причем довольно сильного.
McClintock [2], рассматривая стрессы, которые могут стать причиной перестройки генома, поставила процесс культивирования тканей на первое место. Действительно, поранение при выделении экспланта, стерилизующие агенты, отличающийся от нормы фон питательных веществ и гормонов и т.п. могут рассматриваться как сильные неблагоприятные воздействия. Исследованию изменчивости генома в условиях in vitro посвящено очень много работ [3]. В последние 10— 15 лет преобладает анализ вариаций непосредственно на уровне ДНК с использованием молекулярных методов, главным образом различных видов ПЦР [4]. Выяснено, что введение в культуру in vitro сопровождается изменением характера метилирования многих сайтов, что может приводить не только к изменению активности генов, но и к мутациям.
Для ряда культур тканей и растений-регене-рантов описана активация мобильных элементов генома. У регенерантов кукурузы была отмечена индукция транспозонов "Активатор—диссоциа-тор" (Ac-Ds), "Супрессор—мутатор" (Spm) и "Му-татор" (Mu). У табака описан ряд ретротранспо-зонов, транскрибирующихся in vitro. Инсерция ретротранспозона Tntl в ген нитратредуктазы привела к инактивации этого гена [5]. Активация мобильных элементов отмечена в культуре тканей и у растений-регенерантов ржи [6]. У риса описаны индуцированные культивированием in vitro перемещения по геному ДНК-транспозо-нов разных типов и увеличение числа копий ре-тротранспозона Tos17 [7].
С другой стороны, клетки in vitro можно подвергать дополнительным воздействиям, культивируя их при повышенной температуре, в условиях дефицита кислорода или в присутствии токсичных веществ. Используя ткани, культивируемые в течение разного периода времени, можно сравнить реакцию на стрессоры молодых и хорошо адаптированных к условиям in vitro культур. Влияние дополнительных стрессовых факторов на геном культивируемых клеток изучено пока явно недостаточно.
Целью данной работы было сравнение уровня генетической изменчивости в культуре тканей кукурузы при культивировании в стандартных и в стрессовых условиях. В качестве стрессового фактора были взяты ионы меди, так как этот тяжелый металл оказывает ярко выраженное и легко регистрируемое негативное действие на рост каллуса кукурузы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектом исследования были две каллусные линии кукурузы (Zea mays L.) ARm15 и ARm22, полученные из незрелых зародышей. Каллус
культивировали на питательной среде Мурасиге-Скуга, содержащей 30 г/л сахарозы и 2 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д). Каждая линия происходила от одного зародыша. Каллус выращивали в культуральной камере при температуре 26°С, освещенности 2 клк при длине светового дня 16 ч. Линию ARm15 культивировали 8 месяцев после получения каллуса, а линию ARm22 — 2 года.
Для создания стресса каллусную ткань кукурузы, разделенную на одинаковые инокулюмы массой 15—20 мг, культивировали на среде, содержащей CuSO4 • 5H2O, в течение месяца. Концентрация ионов меди в среде составляла 0.2—1.2 мМ. По истечении месяца определяли увеличение сырой массы тканей, рассчитывали индекс роста, как отношение прироста к начальной массе каллусов, и регистрировали наличие зон некроза. Контрольные каллусы культивировали на стандартной среде без ионов меди. В каждом варианте опыта анализировали по 20 каллусов, опыты повторяли три раза. Для каждого из вариантов была рассчитана средняя величина и определена стандартная ошибка.
Для определения влияния стрессора на уровень генетической изменчивости каллусы культивировали в течение месяца на среде с ионами меди, затем от каждой линии кукурузы брали по 10 проб каллуса весом 100 мг, из них выделяли ДНК по методике, описанной Dellaporta с соавт. [8] и адаптированной нами под небольшие объемы. Концентрацию ДНК оценивали с помощью спектрофотометра ND-1000 ("Nano Drop Technologies", США). Выделенную ДНК хранили при —20°С.
Оценку изменчивости генома проводили двумя ПЦР-методами - RAPD и ISSR.
Из набора праймеров, рекомендованных в литературе для проведения ПЦР с ДНК кукурузы, были отобраны варианты, обеспечивающие наибольшее число хорошо различимых фрагментов, и определены условия ПЦР: концентрация ДНК-матрицы, концентрация праймера и температура отжига. Последовательности RAPD- и ISSR-праймеров, использованные в работе, представлены в табл. 1, они были синтезированы научно-производственной фирмой "Литех" (Россия).
Реакционная смесь для ПЦР объемом 25 мкл содержала 2.5 мкл 10х Taq-буфера ("Силекс", Россия), 0.0125% крезолового красного, 6.25% глицерина, по 0.12 мМ каждого dNTP, 0.2-0.5 пМ праймера, 50 нг ДНК и 2 ед. термостабильной Taq-ДНК-пoлимеразы ("Силекс"). На реакционную смесь наслаивали 20 мкл минерального масла.
Для ПЦР применяли следующий температурный режим: начальная денатурация 2 мин при 94°С; 5 циклов: денатурация 20 с при 94°С, отжиг 10 с при 34-56°С, элонгация 10 с при 72°С; 35 циклов: денатурация 5 с при 94°С, отжиг 5 с
при 34—56°С, элонгация 5 с при 72°С; заключительная элонгация 2 мин при 72°С. Для амплификации ДНК использовали программируемый тер-моциклер Терцик ("ДНК-технология", Россия).
Продукты амплификации разделяли путем электрофореза в 2% агарозном геле в TBE-буфере с последующим окрашиванием бромистым эти-дием и фотографированием в УФ-свете фотоаппаратом Canon Power Shot A570IS. Для определения длины фрагментов использовали маркер М26 (100 bp + 2 Kb + 3 Kb) ("СибЭнзим", Россия).
Анализ повторяли дважды.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Влияние ионов меди на каллус кукурузы. Медь является эссенциальным элементом, но в высоких концентрациях вызывает различные нарушения метаболизма растений [9]. Для исследования влияния стрессора на геном клеток кукурузы необходимо было определить концентрации, при которых рост культивируемых клеток был бы в той или иной степени подавлен, но сохранялась жизнеспособность части культуры.
Ионы меди ингибировали рост каллуса кукурузы во всех испытанных концентрациях. При содержании меди в среде менее 0.6 мМ линия ARm22 продемонстрировала более высокую устойчивость (рис. 1). Например, при концентрации ионов меди 0.4 мМ индекс роста двух линий, выраженный в процентах к контролю, различался на 30%. Возможно, выращиваемая в течение более долгого времени линия ARm22 была лучше адаптирована к условиям in vitro и не испытывала дополнительного стресса, связанного с культивированием. Более высокие дозы меди
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.