научная статья по теме ВЛИЯНИЕ ИОНОВ СЕРЕБРА НА МЕТАБОЛИЗМ МЕДИ И ЭКСПРЕССИЮ ГЕНОВ МЕДЬТРАНСПОРТНЫХ БЕЛКОВ В ПЕЧЕНИ КРЫС Математика

Текст научной статьи на тему «ВЛИЯНИЕ ИОНОВ СЕРЕБРА НА МЕТАБОЛИЗМ МЕДИ И ЭКСПРЕССИЮ ГЕНОВ МЕДЬТРАНСПОРТНЫХ БЕЛКОВ В ПЕЧЕНИ КРЫС»

ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2008, том 418, № 4, с. 549-552

БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ

УДК 577.170.49:546.59+591.481.1+577.21

ВЛИЯНИЕ ИОНОВ СЕРЕБРА НА МЕТАБОЛИЗМ МЕДИ И ЭКСПРЕССИЮ ГЕНОВ МЕДЬТРАНСПОРТНЫХ БЕЛКОВ

В ПЕЧЕНИ КРЫС

© 2008 г. С. А. Клотченко, Н. В. Цымбаленко, К. В. Соловьев, А. Н. Скворцов, Е. А. Затуловский, П. С. Бабич, Н. А. Платонова, М. М. Шавловский,

Л. В. Пучкова, М. Броджини

Представлено академиком А.Д. Ноздрачёвым 30.05.2007 г. Поступило 16.06.2007 г.

В последние годы получены убедительные данные, свидетельствующие о том, что широко применяемый противораковый препарат циспла-тин переносится в клетки с участием СШ1, белка плазматической мембраны, принадлежащего к семейству высоко аффинных импортеров меди [1]. Однако трудно представить, что Р1(П), координационная химия которой принципиально отличается от химии Си(1) [2], связывается и передается в клетку по идентичному с Си+-ионами механизму. К-концевой внеклеточный домен СТШ длиной 65 аминокислотных остатков содержит три мотива, обогащенные гистидином и/или метиони-ном (мотив 1: 1МВН8ННМОМ8УМБ13, мотив 2: 190Р8НННРТ26 и мотив 3: 39БММММРМТ46). Все мотивы важны для переноса Си(1) [3]. Какие из них принимают участие в транспорте цисплатина, остается неизученным. Мы думаем, что благодаря способности платины быстро образовывать кинетически предпочтительные комплексы с серой [2] критическую роль в связывании цисплатина могут играть метионин-богатые мотивы СШ1, и в особенности ближайший к плазматической мембране мотив 3. Так как ионы меди вытесняют платину из ее комплексов с Б-донорами [4], возможно, что ионы меди, связанные с мотивом 2, могут вызывать диссоциацию платины из комплекса с атомами серы метионина и способствовать ее попаданию в купрофильную пору СТЯ1. Для изучения роли меди в переносе платины полезной моделью могут быть лабораторные животные с низким содержанием меди в крови. Из-

вестно, что добавление хлорида серебра в пищу лабораторных крыс через две-три недели приводит к резкому снижению концентрации меди в плазме крови [5]. Изменяется ли при этом экспрессия генов медьтранспортных белков, остается неизученным. В представленной работе у крыс, получавших с пищей хлорид серебра, определен уровень экспрессии гена СТЯ1 и генов других медьтранспортных белков, метаболически связанных с СТШ. Если связь между метаболизмом меди и переносом платины в клетки существует, то понимание механизма этой связи в перспективе может способствовать созданию менее токсичных комбинаций противораковых препаратов.

Работа выполнена на взрослых самцах линии Вистар с массой тела около 200-250 г, (питомник "Рапполово", Ленинградская область). Контрольная группа крыс получала стандартизированный корм и воду без ограничений. В измельченный увлажненный корм опытной группы замешивали хлорид серебра из расчета 50 мг А§С1 на 1 кг массы тела крыс в сутки. Кормление проводили в течение четырех недель. Относительную транскрипционную активность генов, кодирующих церуло-плазмин (ЦП, Ср, № 2387, мРНК - КМ_012532) и ЦП, связанный с клеточной мембраной через гликозил-фосфатидил инозитоловый якорь (ГФИ-ЦП, Ср, № 2387, мРНК - АБ202115), которые формируются в ходе альтернативного сплайсинга из общего первичного продукта транскрипции, АТФазу Менкеса (АТР7А, № 2179), АТФазу Вильсона (АТР7В, № 2180), СТЯ1 {БЬС31А1, № 620059), предшественник Р-амилоидного белка (АРР, Арр, № 2139), Си,2п-супероксиддисмутазу (СОД1, Бой1, № 3731), Мп-супероксиддисмутазу (СОД2, Бой2, № 3732) и изоформу 1 субъединицы IV цитохром-с-оксидазы, кодируемую ядерным геномом (ЦО, Сох411, № 68374), оценивали методом полуколичественной ОТ-ПЦР. В скобках приведены обозначения генных продуктов, использованных в тексте сообщения, и их названия по номенклатуре ЯОБ. Экстракция тотальной РНК, проверка ее чистоты, тесты на присутствие

Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Российской академии медицинских наук, Санкт-Петербург

Санкт-Петербургский государственный политехнический университет Научно-исследовательский институт фармакологии им. Марко Негри, Милан, Италия

550

КЛОТЧЕНКО и др.

1 2 3 4 5 6 7

Рис. 1. Уровень иммунореактивных полипептидов це-рулоплазмина и его изоформ в сыворотке крови Ag-крыс. а - после электрофореза в неденатурирую-щих условиях гель окрашен на оксидазную активность о-дианизидином. б - после электрофореза в ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия полипептиды ЦП выявлены методом иммуноблоттинга. в - апо- и холо-изоформы ЦП выявлены методом иммуноблоттинга после разделения в ПААГ в неденату-рирующих условиях. 1, 2 - сыворотки контрольных крыс, 1 мкл; 3-7 - сыворотка Ag-крыс. Образцы, использованные для окрашивания о-дианизидином, содержали 1 мкл сыворотки, для иммуноблоттинга -0.1 мкл. Электрофорез проводили в 7.5%-ном полиа-криламидном геле в прерывистой системе рН.

в препаратах примесей ДНК и/или продуктов деградации РНК, условия проведения реакции обратной транскрипции и сопряженной с ней ПЦР, а также определение относительной концентрации мРНК описаны ранее [6]. Последовательности специфических праймеров для мРНК, кодирующих ЦП, ГФИ-ЦП, CTR1 и Р-актин, приведены в работе [6], для мРНК, кодирующей АТР7А, АТР7В и АРР, - в [7]. Для выявления СОД1-мРНК использовали прямой: 5'-acaatacacaaggctg-taccactgcagg-3' и обратный: 5'-tcatcttgtttctcgtggac-caccatag-3' праймеры (температура отжига 62°С, длина продукта 220 п.н.). мРНК, кодирующую СОД2, выявляли с помощью 5'-tccctgacctgccttacgac-tatgg-3' и 5'-gcttgatagcctccagcaactctcc-3', прямого и обратного праймеров соответственно (температура отжига 62°С, длина продукта 285 п.н.). Для идентификации ЦО-мРНК были использованы праймеры: прямой 5'-aagagagccatttctacttcggtgtg-3' и обратный 5'-caggctctcacttcttccattcattc-3' (температура отжига 60°С, длина продукта 484 п.н.). Подбор праймеров проводили по программе Gene Runner 3.0 (http://www.generunner.com). Все последовательности взяты из базы данных Entrez Gene на сервере www.ncbi.nlm.nih.gov. Присутствие мРНК, кодирующей синтез ЦП митохондриаль-ной локализации (мтЦП), выявляли с помощью прямого праймера на 3'-конец интрона 2 и обратного на экзон 4 [8]. Об оксидазной активности в сыворотке крови судили по интенсивности окисления и-фенилендиамина [9]. Оксидазный ЦП (хо-ло-ЦП) выявляли в геле окрашиванием о-дианизидином [10]. Иммунореактивные полипептиды ЦП идентифицировали методом иммуноблоттинга [6]. Концентрацию Cu, Ag, Fe, Zn и Pt измеряли методом атомно-абсорбционной спектрометрии с электротермической атомизацией и зеемановской коррекцией неселективного поглощения на спектрометре фирмы "Perkin-Elmer", Model 4100ZL, США.

В образцах сыворотки крови измерения проводили без предварительной подготовки. Образцы печени, почек, мозга и мочевой пузырь взвешивали, измельчали, гомогенизировали в смеси 5%-ного БББ и 1.5%-ного КаОИ, и полученный гомогенат полностью растворяли при постепенном нагревании.

Крысы, получавшие с пищей ионы серебра (А§-крысы), в течение всего эксперимента были активны, не теряли массу и аппетит, у них не наблюдали расстройств пищеварения. Это полностью согласуется с данными об отсутствии у ионов серебра токсических свойств. Через четыре недели оксидазная активность сыворотки крови, в норме практически полностью принадлежащая ЦП, медьсодержащему белку сыворотки крови, на долю которого приходится почти 99% неклеточной меди [11], у А§-крыс снижалась примерно в 30 раз (1.7 ± 0.51, п = 15, против 53.3 ± ± 7.82, п = 5, мг/100 мл). На фоне отсутствия оксидазной активности, выявляемой о-дианизидином, в крови А§-крыс (рис. 1а) по данным иммуноблоттинга содержание ЦП не меняется (рис. 16). В то же время в крови крыс опытной группы в отличие от контрольной практически отсутствует хо-ло-ЦП, а преимущественной формой является апо-ЦП (рис. 1в). Концентрация меди в сыворотке крови А§-крыс снижается почти в 10 раз (рис. 2а). Это полностью коррелирует с потерей церулоплаз-мином оксидазной активности. Наблюдаемое повышение концентрации железа (рис. 2а), по-видимому, связано с отсутствием оксидазного ЦП, который необходим для встраивания ионов железа в транс-феррин [12]. Концентрация цинка в сыворотке крови А§-крыс не меняется, а содержание серебра соответствует фоновому уровню (рис. 2а).

В печени крыс опытной группы по сравнению с контрольной содержание меди снижается незначительно (рис. 26). Заметно, хотя и не достоверно, снижается и концентрация железа. Возможно, это является следствием нарушения процесса его поступления в клетки, связанного с дефицитом оксидазного ЦП. Содержание цинка практически одинаково в сыворотке крыс обеих групп. Концентрация серебра превышает фоновые значения почти в 60 раз.

Для того чтобы установить, влияет ли отсутствие меди в крови на экспрессию генов метаболической системы меди, определено относительное содержание мРНК, кодирующей: 1) ЦП, медьтранспортную ферроксидазу, 2) СШ1, универсальный импортер меди, 3) АТР7В, медьтранспортную АТФазу Р1-типа, которая включает ионы меди в активные центры ЦП, а также: 4) АРР, катализирующего реакцию Си(П)^Си(1), предшествующую связыванию меди с СТЯ1. Помимо этого проверено, не происходит ли индукция синтеза мРНК, кодирующей АТР7А и ЕФИ-ЦП, которые в гепатоцитах взрослой печени не образуются. Полученные результаты приведены на рис. 3. Они показывают, что профиль взятых в рассмотрение медьтранспортных генов в печени

ВЛИЯНИЕ ИОНОВ СЕРЕБРА

551

30

25

20

15

10

5

0 60

50

40

30

20

10

0

(а)

Си

Бе

7п

Рис. 2. Содержание меди, железа, цинка и серебра в сыворотке крови (а) и печени (б) контрольных (светлые столбики) и Ag-крыс (темные столбики). а - по оси ординат - концентрация металлов, мкМ. Величины концентрации железа разделены на 10, а концентрации серебра умножены на 10. б - по оси ординат -концентрация металлов, мкг/г сырой массы ткани. Каждая группа состояла из пяти крыс. Данные выражены как среднее значение ± среднее квадратичное отклонение. Статистическое сравнение выполнено с использованием коэффициента Стьюдента. Различия считались значимыми при Р < 0.05.

Ag-крыс не меняется. От

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком