СЕНСОРНЫЕ СИСТЕМЫ, 2010, том 24, № 2, с. 168-174
СОМАТОСЕНСОРНАЯ СИСТЕМА
УДК 612.822.3
ВЛИЯНИЕ ИЗМЕНЕНИЯ ТЕМПЕРАТУРЫ СРЕДЫ НА ТОКИ МЕДЛЕННЫХ НАТРИЕВЫХ КАНАЛОВ МЕМБРАНЫ СЕНСОРНОГО НЕЙРОНА ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ЛАЗЕРНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ
© 2010 г. С.А. Подзорова, И.Е. Катина, В.Б. Плахова, В.А. Горобец1, В.О. Петухов1, И.Л. Ячнев, Б.В. Крылов
Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН, 199034, Санкт-Петербург, наб. Макарова, д. 6;
Е-та11:кгу1оу@1п/гап.гы 1Институт физики им. Б.И. Степанова Национальной академии наук Белоруссии, 220072, Минск, пр. Независимости, 68
Поступила в редакцию 01.12. 2009 г.
При помощи метода локальной фиксации потенциала исследовано действие низкоинтенсивного излучения СО2-лазера на мембрану культивируемых нейронов спинальных ганглиев крыс. В качестве «сенсоров» температуры использовались медленные натриевые каналы (N^,1.8). В условиях проводившихся опытов изменение температуры физиологического раствора на 3 °С (от комнатной температуры, равной 22 °С, до верхней границы, составляющей 25 °С) не изменяло ответы медленных натриевых каналов. Нагрев свыше 25 °С сопровождался изменением кинетики ионных токов указанных каналов. При этом энергия излучения, достигавшего мембраны нейрона, равнялась 3.41 • 10-17 Дж. Эта пороговая величина определяет верхнюю границу области существования антиноцицептивной реакции мембраны сенсорного нейрона при воздействии низкоинтенсивного излучения С02-лазера. Можно заключить, что при наших экспериментальных условиях лазерное излучение является низкоинтенсивным (нетепловым), если его энергия ниже указанного порога.
Ключевые слова: низкоинтенсивная лазерная терапия, инфракрасное лазерное излучение, метод локальной фиксации потенциала, ТТХ-резистентные натриевые каналы, ноцицепция.
ВВЕДЕНИЕ
Низкоинтенсивная лазерная терапия успешно применяется для лечения ряда заболеваний. При этом данные о молекулярных механизмах взаимодействия низкоинтенсивного инфракрасного (ИК) излучения с мембраной клетки носят фрагментарный характер, в особенности в отношении излучения среднего и дальнего ИК-диапазона (Кага, 1999). Понимание этих механизмов позволит значительно более эффективно применять лазерные приборы в медицинской практике.
Первая и наиболее успешная попытка поиска молекулярной мишени, отвечающей на низкоинтенсивное (не приводящее к неспецифическим тепловым эффектам в исследуемом объекте) ИК-излучение ближнего и среднего диапазонов, была предпринята при исследовании импульсной активности нейрона-рецептора растяжения ракообразных (Павленко и др., 1975). Цитируемые авторы показали, что в ответ на облучение частота
импульсации нейрона снижалась. Этот эффект устранялся уабаином, специфическим блокато-ром Ка+, К+-АТФазы. Сдвиг мембранного потенциала в гиперполяризационном направлении при воздействии ИК-излучения, ведущий к снижению частоты импульсной активности нейрона, был объяснен активацией натриевого насоса, что, по мнению авторов, явилось следствием активации терморецепторов.
При сравнении ответов рецептора растяжения ракообразных на излучение ближнего и среднего ИК-диапазонов (Павленко и др., 1999; Кучерявых и др., 2003) было установлено, что чувствительность нейрона изменялась на семь порядков величины (от 0.45 до 2.7 • 10-8 Вт • см-2) при переходе от области длин волн 0.85-3 мкм, выделяемой из спектра лампы накаливания при помощи ИК-фильтров к длине волны 10.6 мкм, генерируемой СО2-лазером. При этом установлено, что гиперполяризация мембраны и уменьшение, а при определенной интенсивности излучения и пре-
кращение импульсной активности нейрона, обусловлено нетепловым действием излучения.
Цель нашей работы - исследование влияния изменения температуры среды, вызванного ИК-излучением СО2-лазера на кинетику токов медленных натриевых каналов мембраны (Nav1.8) сенсорного нейрона теплокровных животных. Задача исследования - количественное определение верхнего предела температуры среды, не приводящей к изменению ответов мембраны нейрона и, следовательно, не влияющего на изменение кинетики токов медленных натриевых каналов. Особая роль каналов Nav1.8 заключается в том, что они присутствуют в соме ноцицептивных С-ней-ронов и модулируются сензитизирующими ноци-цепторы агентами, что позволило предположить их участие в кодировании ноцицептивных сигналов (Kostyuk et al., 1981; Gold et al., 1996). Установлено, что возбуждение кожных терминалей С-ноцицепторов нагревом не зависит от ТТХ, что свидетельствует в пользу предположения о наличии ТТХ-резистентных натриевых каналов в этих терминалях (Ревенко и др., 1997). Возможность специфического модулирования потенциа-лочувствительности медленных натриевых каналов представляет большой практический интерес с точки зрения разработки аналгетиков нового поколения (Jarvis et al., 2007) и новых лазерных медицинских аппаратов для аналгезии. Очевидно, что реакция именно этих молекулярных структур мембраны сенсорного нейрона теплокровных животных будет определять ноцицептивную реакцию целостного организма. При исследовании взаимодействия ИК-излучения с мембраной нейрона при помощи метода локальной фиксации потенциала можно попытаться разделить два механизма воздействия этого излучения на мембрану. Один из них, связанный с разогревом окружающей нейрон среды из-за поглощения ею излучения, может проявляться в изменении зависимости констант скоростей процессов активации и инактивации проводимости мембранных ионных каналов от температуры. При этом изменение кинетики токов медленных натриевых каналов, наблюдаемое в реальном масштабе времени, может использоваться для контроля разогрева физиологического раствора. Подчеркнем, что данный методический прием характеризуется не только высокой чувствительностью, но и позволяет количественно оценивать энергию ИК-излу-чения, ведущего к изменению ответов мембраны сенсорного нейрона.
Другой механизм воздействия низкоинтенсивного ИК-излучения на мембрану нервной клет-
ки обусловлен уменьшением потенциалочувс-твительности медленных натриевых каналов (Plakhova et al., 2000; Плахова и др., 2003; 2004).
В настоящей работе предпринята попытка определить температурный и оценить энергетический диапазоны, в которых излучение С02-лазера может считаться низкоинтенсивным (нетепловым). Оценка этого диапазона позволит сформулировать требования к энергетическим характеристикам медицинского лазерного изделия, способного купировать ноцицептивные сигналы при накожной лазерной физиотерапии.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Эксперименты выполняли на культивируемых изолированных нейронах спинальных ганглиев новорожденных крысят линии Wistar. Для выделения нейронов применяли модифицированный метод краткосрочного культивирования (ЕШой, Elliott, 1993), обеспечивающий высокий выход жизнеспособных клеток. Использованная методика выделения подробно описана ранее (Плахова и др., 2003). В работе применяли следующие стандартные растворы (концентрации представлены в ммоль/л). Внеклеточный раствор: №С1 - 65, Саа2 - 2, МgCl2 - 2, холин хлорид - 70, НЕРЕБ-№ - 10, (тетродотоксин) - 0.0001, рН = 7.4. Внутриклеточный раствор: СsF - 100, Nad - 10, СsCl - 40, MgCl2 - 2, НЕРЕБ-N - 10, рН = 7.2. Исключение из растворов ионов калия позволило избавиться от всех компонентов калиевого тока, а ионы фтора во внутриклеточном растворе блокировали кальциевые токи (Kostyuk et al., 1975). Наличие во внеклеточном растворе ионов тетродо-токсина (ТТХ) обеспечивало блокирование быстрых ТТХ-чувствительных каналов, что делало возможным регистрировать ответы только одной популяции ионных каналов - медленных ТТХ-ре-зистентных (Nav1.8). В работе использовали реактивы фирмы "Sigma". Оптическая схема установки представлена на рис. 1. Источником излучения, длина волны которого составляла 10.6 мкм, являлся С02-лазер (1). Мощность излучения контролировалась в пучке, отраженном от передней поверхности оптического клина (2), измерителем мощности (3) типа ИМО-2Н. Для визуализации положения луча С02-лазера в пространстве использовали Не-N лазер (6), луч которого совмещали с ИК-лучом при помощи оптического клина (5). Варьирование мощности ИК-излучения осуществляли путем замены клина (7) из АsGа на клин из КС1. В результате величина коэффициента отражения изменялась в 4.5 раза. Зеркалами (8,
Рис. 1. Оптическая схема установки 1 - СО2-лазер; 2, 5, 7 - оптический клин; 3 - измеритель мощности; 4 - механический экран; 6 - Не-Ые лазер; 8, 9 - зеркало; 10 - экспериментальная ванночка.
9) излучение направляли в экспериментальную ванночку (10) с наружным раствором, в которой находился исследуемый сенсорный нейрон. Диаметр ванночки равнялся 0.8 см, высота 0.18 см. Подачу излучения на клетку и прекращение облучения проводили при помощи механического экрана (4).
Величину мощности излучения на поверхности физиологического раствора определяли при помощи дополнительного измерителя мощности типа ИМО-2Н, который устанавливали в месте расположения ванночки. При этом на входе измерителя мощности находилась диафрагма, диаметр отверстия которой равнялся диаметру ванночки (0.8 см).
Измерения температуры физиологического раствора во время его облучения проводили при помощи калиброванной термопары Си-Со, защищенной от воздействия излучения специальным экраном. Термопару помещали в раствор до начала его облучения, при этом фиксировали начальную температуру раствора.
Распределение мощности излучения по сечению лазерного пучка было измерено в отдельном опыте с помощью калиброванных диафрагм, располагавшихся в плоскости поверхности физиологического раствора. Мощность излучения, прошедшая диафрагму, измеряли дополнительным измерителем мощности типа ИМО-2Н, находившимся за диафрагмой.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
На рис. 2 приведены записи токов в ответ на прямоугольные импульсы напряжения, приложенные к мембране исследуемого нейрона в контрольном опыте до начала облучения и во время облучения нейрона при мощности излучения, па-
Время, мс
0 5 10 15 20
Рис. 2. Влияние излучения на кинетику медленных натриевых токов сенсорных нейронов Записи токов при деполяризации от исходного потенциала -
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.