БИОФИЗИКА, 2015, том 60, вып. 1, с. 136-142
= БИОФИЗИКА КЛЕТКИ =
УДК 577.356, 57.083.133
ВЛИЯНИЕ ИЗОТОПНОГО СОСТАВА ВОДЫ НА ПPОДУКЦИЮ БИОМАССЫ Rhodococcus erythropolis
© 2015 г. А.А. Самков, С.С. Джимак, М.Г. Барышев, Н.Н. Волченко, А.А. Худокормов, С.М. Самкова, Э.В. Карасева
Кубанский государственный университет, 350040, Краснодар, ул. Ставропольская, 149
E-mail: andreysamkov@mail.ru Поступила в p едакцию 24.04.14 г.
Обнаружено влияние изотопного состава воды на концентрацию клеточной биомассы нефте-окисляющей актинобактерии Rhodo^^us егуШгороШ ВКМ Ас-2017Д при культивировании на жидких питательных средах. Величина эффекта определялась условиями постановки экспериментов, включающими последовательное использование гидрофильного и гидрофобного питательных субстратов - сахарозы и гексадекана. Показано, что при инокуляции клетками Rhodo^^us erythropolis ВКМ Ас-2017Д, выращенными на средах с сахарозой и содержанием дейтерия в воде 71 и 98 ррт, аналогичных по минеральному и изотопному составу средам с гексадеканом, наблюдается существенное увеличение продукции клеточной биомассы по сравнению с контрольным образцом, в котором использовали воду с концентрацией дейтерия, равной 150 ррт.
Ключевые слова: дейтерий, родококки, клеточная биомасса, питательная среда, адаптация микроорганизмов.
Влияние физико-химических свойств ср еды на функционирование биологических систем привлекает в настоящее время все более пристальное внимание исследователей. Расширение поля задач в этой области связано со многими нерешенными вопр осами, возникшими пр и анализе результатов слабых воздействий на живую материю различных уровней организации. Изотопный состав воды является одним из важнейших физико-химических факторов, значение которого не вызывает сомнений [1,2]. Установлено, что биологические эффекты наблюдаются при небольших естественных вариациях изотопного состава воды как в сторону уменьшения, так и увеличения относительно стандартной средней океанской воды [2]. В результате многочисленных исследований воздействия воды с повышенным относительно природного содер жанием дейтерия на биологические системы были обнаружены р азличные дозо- и объ-ектозависимые эффекты как позитивного, так и, что более характерно, негативного характера [1,3-6].
В настоящее время получили значительное развитие исследования биологических эффектов воды с пониженным содержанием дейтерия. И с-следования, проведенные на различных живых организмах [6-9], показали преимущественно положительные эффекты. Однако, как и в случае с тяжелой водой, эффекты носили дозоза-
висимый характер [3,10,11]. Большое значение при этом имел выбор биообъекта.
Изучение механизмов влияния изотопного состава воды на работу биологических систем показало их сложность и разнообразие. Были высказаны пр едположения о воздействии дейтерия на системы водородных связей, обеспечивающие структуру и функции макромолекул. Отмечалось, что водородные связи с участием дейтерия несколько пр очнее обычных. П ри инкубации клетки в воде с измененным относительно первоначального соотношением D/H изменяется не только соотношение дейтериевой и протиевой воды внутри биологической системы как р астворителя, но также осуществляется изотопный обмен в гидроксильных, сульф-гидрильных, карбоксильных и аминогруппах молекул всех органических соединений [1,1214].
В связи с растущим количеством исследований биологических эффектов легкой воды интерес представляет изучение влияния такой водной среды на бактерии, в частности на ро -дококков. Данная гр уппа микроорганизмов эво-люционно адаптирована к утилизации и трансформации широкого круга соединений углево -дородной природы. Природными соединениями, утилизируемыми актинобактериями, в том числе представителями рода Rhodococcus, являются углеводо роды нефти, поступающие в био-
сфер у естественным или техногенным путем, а также различные другие природные биологически устойчивые соединения, в том числе гидрофобные. Основным местообитанием актино-бактерий являются почвы, гуминовые и другие органические соединения которых служат практически неисчерпаемым депо углерода, доступного для поддер жания жизнедеятельно сти данной группы бактерий. Для осуществления характерной для родококков экологической K-стратегии у них имеется соответствующий катаболи-ческий ферментный аппарат, а также система энергоэффективного транспорта углеводородных молекул в клетку, представленная продукцией биогенных поверхностно-активных веществ, развитой клеточной стенкой, гидрофо-бизованной миколовыми кислотами и другими соединениями [15-17]. Cпектр физиолого-био-химических особенностей актинобактерий обусловил их применение в качестве биологического агента в биотехнологии трансформации гидрофобных соединений и, прежде всего, в экологической биотехнологии. В настоящее вр е-мя родококки являются основой или, по меньшей мере, важным компонентом практически любого нефтеокисляющего биопрепарата или микробиологической технологии биоочистки углеводородзагрязненных почв и грунтов [18,19].
Родококки способны к утилизации как са-харозы, так и гексадекана в составе жидкой питательной среды. Известно, что при потреб -лении данных субстратов используются принципиально разные катаболические механизмы, включающие экспрессию соответствующих генов, работу ферментов и структурных компонентов клетки. В случае утилизации актино-бактериями гексадекана большое значение придается формированию и работе специфических атрибутов катаболизма углеводородов - развитой гидрофобной клеточной стенки, обеспечивающей солюбилизацию гидр офобного субстра -та, синтезу биогенных поверхностно-активных веществ, связанных с клеточной стенкой и/или поступающих в окружающую среду, и, наконец, катаболическим ферментам. Таким образом, при последовательной замене сахарозы на гек-садекан в среде культивирования бактериальной культуре требуются определенные структурно-физиологические и биохимические перестройки. В этой связи для выявления зависимости ответа растущей бактериальной культуры на изменение соотношения D/H воды жидкой питательной среды был поставлен эксперимент, совмещающий многоэтапную адаптацию культуры к условиям пониженного содержания дей-
терия и замену субстрата, ра ссматриваемую как стрессовый фактор.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Воду с пониженным содер жанием дейтерия производили на установке ЛВ-1 [10,20] в Бизнес-инкубаторе Кубанского государственного университета.
Опр еделение концентрации дейтерия в полученной воде было проведено на импульсном ЯМР-спектрометре JEOL JNM-ECA 400 MHz в Центр е коллективного пользования «Диагностика структуры и свойств наноматериалов» КубГУ по модифицированной методике ФР. 1.31.1999.00073 «Методика выполнения из-мер ений содержания дейтерия в воде, водно-органических и органических раствораx методом спектроскопии ядерного магнитного резо -нанса» [21].
В работе использовали штамм бактерий Rhodococcus erythropolis ВКМ Ас-2017Д, депонированный во Всероссийской коллекции микроорганизмов, используемый в научно-исследовательской и практической деятельности [22].
Для культивирования штамма использовали жидкую минер альную среду следующего состава (г/л): KNO3 - 4; Na2HPO4-12H2O - 1,4; KH2PO4 - 0,6; MgSO4 7H2O - 0,8; стандартный раствор микроэлементов (10 элементов) -1 мл/л ср еды. В качестве единственного источника углерода и энергии использовали гекса-декан (C16H34) или сахарозу в количестве 10 г/л среды. Растворы компонентов среды стерилизовали автоклавированием р аздельно при р аз-ных режимах, после чего в стерильных условиях смешивали в необходимой пропорции. Культивирование вели в колбах объемом 250 мл на орбитальном шейкере при 110 об/мин и 24°С.
Определение концентрации биомассы выполняли гр авиметрическим методом по усовершенствованной методике Brown [23]. Клетки осаждали центрифугированием на центрифуге РС-6МЦ при 3000 g и 10°С. При использовании гексадекана в качестве источника углерода и энергии, согласно правилам определения концентрации биомассы при культивировании на углеводородах [24], осажденные клетки дополнительно промывали гексаном для удаления остатков углеводо родного субстрата, адсор би-ровавшегося на поверхности микроорганизмов и посуды.
Оптическую плотность культур, растущих на сахарозе, измеряли в 3-миллиметровой кювете пр и X = 670 нм. Оптическая плотность использована для учета динамики роста кон-
Pис. 1. Схема пересевов родококка на cpеды c р азличными соотношениями D/H (ppm) и питательными субстр атами.
центрации биомассы по стандартной методике [25].
С татистическую обр аботку полученных данных о существляли методами вар иационной статистики с использованием t-кр итер ия Стьюден-та. Достоверным считали различие при p < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Была пр иготовлена сер ия жидких минер аль-ных сред, различающихся соотношением D/H в воде. Для этого в стер ильных условиях смешивали аликвоты ср ед, пр иготовленных на о с-нове исходной дистиллированной воды (150 ± 0,9 ррт) и воды с пониженным содержанием дейтерия (45 ± 1,7 ррт). Соотношение легкая вода/обычная вода вар ьир овали от 0 до 100% с шагом 25%. Таким обр азом, в экспер именте использовали пять образцов воды для приготовления сред с соотношениями D/H, равными
45 ± 1,7; 71 ± 2,1; 98 ± 1,4; 124 ± 1,7; 150 ± 0,9 ррт до стер илизации ра створ ов автоклави-рованием.
Схема эк спер имента п р иведена на р и с. 1. Клетки Rhodococcus erythropolis ВКМ Ас-2017Д были дважды стерильно отмыты от остатков ср еды культивир ования (питательного агар а) минеральной средой без источника углерода, пр иготовленной на воде с D/H 150 ррт. Клетки были использованы для инокуляции серии сред первого этапа эксперимента, где в качестве питательного субстрата использовали сахарозу. Клетки, выр о сшие на сахар озе, пр и известных соотношениях D/H в среде, были использованы для инокуляции серии ср ед втор ого этапа экспер имента, где в качестве субстрата был использован гексадекан, а водная фаза имела те же соотношения D/H, что и на предыдущем этапе.
На пер вом этапе эк спер имента клетки Rhodococcus erythropolis ВКМ Ас-2017Д куль
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.