БИОФИЗИКА, 2014, том 59, вып. 1, с. 108-111
= БИОФИЗИКА КЛЕТКИ =
УДК 577.3
ВЛИЯНИЕ К+ -ДЕПОЛЯРИЗАЦИИ И ИЗМЕНЕНИЯ КОНФОРМАЦИИ МЕМБРАННЫХ БЕЛКОВ НЕРВНОГО ВОЛОКНА НА СОСТОЯНИЕ МИЕЛИНА
© 2014 г. Н.Н. Родионова, Е.З. Бибинейшвили, А.Р. Б раже, А.И. Юсипович,
Г.В. Максимов, А.Б. Рубин
Биологический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова,
119991, Москва, Ленинские горы E-mai: vedmezhonik@mail.ru Поступила в p едакцию 02.04.12 г. После доработки 04.03.13 г.
C помощью методов спектроскопии резонансного комбинационного рассеяния и флуоресцентной микроскопии показано, что в миелиновом нервном волокне ионы мембранно-связанного кальция и молекулы каротиноидов содержатся в интернодальной области миелина. При К +-деполяризации миелинового нервного волокна нами было зарегистрировано уменьшение концентрации мембранно-связанного кальция и увеличение микровязкости миелина. Выявлены изменения уровня мембранно-связанного кальция и микровязкости миелина при блокировании К +-каналов и изменении конформации белков миелинового нервного волокна. Полученные результаты свидетельствуют о наличии взаимосвязи между состоянием мембранных белков нервного волокна, распределением ионов мембранно-связанного кальция и микровязкостью миелина.
Ключевые слова: аксон, шванновская клетка, миелин, мембранные белки, мембранно-связанный кальций.
В настоящее время актуальной задачей биофизики и физиологии нервной клетки является исследование изменений состояния и стр уктуры миелина при проведение серии потенциалов действия (СПД). Известно, что в зрелой нервной клетке аксон и шванновская клетка совместно участвуют в процессе проведения СПД. Взаимодействие аксона и шванновской клетки отражается и на возбудимости аксона, состоянии нейрофиламентов, аксональном транспорте, морфологии аксона [1], локализации ионных каналов в аксоне [2], формировании ионных каналов шванновской клетки [3,4], обмене ли-пидов (из аксона в миелин пер ено сятся липиды (фосфоинозитиды) и их предшественники для реутилизации ферментами миелина и др. [5]). Изменение стр уктуры миелина пр иводит к нарушению процессов, основанных на взаимодействии аксона и шванновской клетки. Структура и состояние миелина, в свою очередь, может
Сокращения: СПД - серия потенциалов действия, ТЭА -тетраэтиламмоний, пХМБ - пара-хлормеркурибензоат, Сам+ш - мембранно-связанный кальций, Са2+ - свободный внутриклеточный кальций, К Р - комбинационное рассеяние.
меняться при изменении конформации мембранных белков нервного волокна.
При проведении СПД в периаксональном пространстве миелинового нервного волокна увеличивается концентрация К + [6]. Это увеличение пр иводит к поступлению К + и молекул воды в шванновскую клетку, набуханию миелина и выбр осу С а2+ через специфические структур ы волокна (насечки Шмидта-Лантермана). Результаты математического моделирования показывают, что если сопротивление миелина и характер проведения СПД существенно зависят от концентрации К + в соответствующем участке нервного волокна, то такая зависимость может приводить к спонтанным хаотическим нарушениям возбудимости нерва [7]. Однако прямых экспериментальных данных о зависимости структур ы и состояния миелина от концентрации К + в экстраклеточной среде в настоящее время явно недостаточно.
Цель работы заключается в исследовании роли деполяризации мембран аксона и шван-новской клетки, а также ионов мембранно-свя-занного кальция и конформации мембранных белков в изменении вязкости миелина.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В качестве объекта исследования использовали миелиновые нервы лягушки (Rana temporaria). После препарирования изолированный нерв выдер живали в течение 30 мин в ра створе Рингера для холоднокровных позвоночных (мМ: NaCl - 100; KCl - 2; CaCl2 - 1,08; HEPES -10; рН 7,4; 18-20°C). В работе применяли также раствор Рингера для холоднокровных позвоночных с повышенной концентрацией ионов калия (мМ: NaCl - 52; KCl - 50; CaCl2 - 1,08; HEPES - 10; рН 7,4; 18-20°C), блокатор Cа2+-каналов верапамил (Sigma, CША, конечная концентрация 10-4 М), блокатор К+-каналов тет-раэтиламмоний (ТЭА) (Мегск, Германия, конечная концентрации 10-2 М), блокатор свободных сульфгидрильных групп экстраклеточных участков белков пара-хлор меркурибензоат (пХМБ) (Fluka, Швейцария, конечная концентрация 10-4 М).
Изменения содержания мембранно-связанного Cа2+ (CаM"Cв) регистрировали с помощью флуоресцентной микроскопии, используя зонд хлортетрациклин (Sigma, CША, конечная концентрация 10-4 М) - максимум поглощения Апогл = 380-400 нм, максимум флуоресценции Афлу = 520-530 нм [8]. Нер в инкубировали 20 мин. Изменение концентрации ионов свободного внутриклеточного кальция (Cа2B") оценивали по интенсивности флуоресценции зонда fluo-3AM (Sigma, CША, конечная концентрация 10-6 М) - максимум поглощения ^погл = 506 нм, максимум флуоресценции ^флу = 526 нм [9]. Нерв инкубировали 10 мин.
Упорядоченность жирнокислотных хвостов молекул липидов плазматических мембран (микровязкость) исследовали методом резонансной спектроскопии комбинационного рассеяния (К Р) с помощью природной метки C40-каpоти-ноидов [10]. В работе использовали КР-спек-трометр с возбуждением от твердотельного Nd-лазера (473 нм, мощность лазера 18 мВт), спектральная область пр ибора составляла 400850 нм. Распределение молекул каротиноидов в интернодальной области и перехвате Ранвье исследовали с помощью Микро-КР спектрометра NTEGRA (НТ-МДТ, Зеленоград) (длина волны возбуждения 532 нм; поле сканирования 38 х 38 мкм, 8x8 измерительных точек).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБCУЖДЕНИЕ
Известно, что в миелиновом нервном волокне содержатся молекулы кар отина C40 [10], распределение которых между перехватом Ран-
150
К 100
н
о
►лГ f—
о
g 50
CQ S
О
х
<и
Рис. 1. Типичный спектр комбинационного рассеяния нерва в перехвате Ранвье (серый) и в межперехватном сегменте (черный). Отмечены пики 1165 и 1530 см-1, характерные для молекул каротиноидов.
вье и межперехватным участком неизвестно. Мы пр оводили К Р-сканирование нервного волокна и сравнивали амплитуду интенсивности полос спектра КР каротиноидов в перехвате Ранвье и межперехватном участке (рис. 1). Амплитуда полосы 1165 см-1 оказалась больше в миелине межперехватного участка, чем в перехвате Ранвье. Известно, что по изменению К Р-спектров каротиноидов можно судить об изменении упорядоченности окружающих их жирно-кислотных остатков липидов [11] и полученное распределение спектров К Р этих молекул в нервном волокне позволяет оценить изменение вязкости мембран в различных областях клетки.
Ранее с помощью изотопных и гистохимических методов было показано, что определенное количество Са;м+в содержится в миелине и его уровень снижается пр и проведении СПД [12]. В настоящем исследовании обнаружено, что в о сновном С ам+в нер вного волокна локализован в миелине и насечках Шмидта-Лан-термана.
В ходе работы мы выявили перераспределение С а2+ в миелине и С а2*" в аксоплазме
мсв си
и/или цитоплазме шванновской клетки пр и К+-деполяризации нервного волокна (таблица, рис. 2), а также изменение вязкости миелина (рис. 3). Установлено, что в условиях К+-депо-ляризации вязкость миелина увеличивается, уровень Сам+в снижается (рис. 2), а Са2+ -кратковременно увеличивается. При инкубации волокна с блокатором Са2+-каналов - верапа-милом, пр и К+-деполяризации уровень Са2+ не повышается (таблица). Вероятно, при К+-депо-ляризации происходит десорбция Сам+в в экс-
Частотный сдвиг, см-1
110 РОДИОНОВА и др.
Изменения Са2+ и Сам+в в миелиновом нервном волокне при К +-деполяризации
Оцениваемая характеристика Интенсивность флуоресценции зонда после К +-деполяризации (отнесенная к контролю)
Количество С а;м+в 0,90 ± 0,05
Количество С а2+ 1,31 ± 0,07
Количество С а2+ при блоке С а 2+-каналов 1,00 ± 0,02
Примечание. Данные представлены как среднее ± ошибка среднего, п = 6.
траклеточную среду (возможно, в периаксо-нальное пр остранство), а повышение Са2+ обусловлено активацией потенциал-зависимых С а2+-каналов.
Зарегистр ированое увеличение вязкости миелина при К+-деполяризации может быть обусловлено изменением конформации мембранных белков нервного волокна (изменение потенциала мембран миелина, аксона и шван-новской клетки, увеличение Са2+, снижение С а;м+в, происходящие при К+-деполяризации не могут не отражаться на конформации мембранных белков нервного волокна). Сама по себе десор бция Сам+в вряд ли может быть причиной увеличения вязкости миелина, так как приведет к увеличению электростатического отталкивания отрицательно-заряженных головок фосфо-липидов, входящих в со став мембран и, следовательно, разупорядоченности жир нокислотных остатков липидных хвостов [13].
В следующей серии экспериментов исследовали роль структурных белков и активности К+-каналов в изменении вязкости миелина и Са ?+„.
Известно, что ТЭА меняет возбудимость нервных волокон, блокируя К+-каналы и вызывая деполяризацию аксолеммы и плазматической мембраны шванновской клетки [14]. При измении со стояния К+-каналов под действием ТЭА, мы зарегистрировали некоторое увеличение вязкости мембран миелина, а также кратковременное снижение Са^ (рис. 2 и 3).
Известно, что пХ МБ блокир ует свободные БН-группы белков [15] и вызывает при этом изменения кинетики Ка+-каналов [16], К+-кана-лов [17], снижает амплитуду и скорость пр ове-дения потенциала действия [18,19], но не меняет потенциал покоя [20]. Нами установлено, что инкубация миелинового нервного волокна с пХМБ пр иводит к обратимой десорбции С а?+ но не изменяет вязкость миелина.
мсв*
Таким образом, мембранный потенциал и активность К+-каналов может влиять на степень разупорядоченности жирно-кислотных о статков липидных хвостов мембран нервного волокна, а изменение конфор мации мембр анных белков за счет блокирования свободных БН-групп и уровень Са;м+в - нет.
Итак, К+-деполяризация мембран миелино-вого нервного волокна уменьшает содержание ионов мембранно-связанного кальция в межпе-
I Контроль П пХМБ □ ТЭА
I I К+-деполяризация
1.6
ч 1.4
<и
И
н о 1.2
-С 1.0
г*|
-С 0.8
0.6
ю
Рис. 2. Изменения концентрации
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.