ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 50, № 6, с. 587-592
УДК 581.138.1
ВЛИЯНИЕ КАЛЬЦИЯ И РИЗОБИАЛЬНОЙ ИНФЕКЦИИ (Rhizobium leguminosarum) НА ДИНАМИКУ СОДЕРЖАНИЯ ОКСИДА АЗОТА В КОРНЯХ ЭТИОЛИРОВАННЫХ ПРОРОСТКОВ ГОРОХА (Pisum sativum L.)
© 2014 г. А. К. Глянько, А. А. Ищенко, А. В. Степанов
Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН, Иркутск 664033
e-mail: akglyanko@sifibr.irk.ru Поступила в редакцию 25.03.2014 г.
С помощью флуоресцентного зонда (4,5-диаминофлуоресцеин диацетата) изучена зависимость изменения содержания оксида азота в поперечных срезах корней 2-суточных этиолированных проростков гороха посевного (Pisum sativum L.) от действия экзогенного кальция (Са2+) и ризобиальной инфекции (Rhizobium leguminosarum bv viceae). Показаны флуктуации в уровне оксида азота в корнях при инкубации проростков в воде, растворе CaCl2 и при ризобиальной инфекции, что свидетельствовало об определенном ритме генерации оксида азота. Экзогенные факторы (Са2+ и ризобиаль-ные штаммы) изменяли временную динамику уровня NO по сравнению с контрольным вариантом (вода).
Б01: 10.7868/8055510991406004Х
Бобово-ризобиальный симбиоз (БРС) — мутуали-стическое сожительство бобовых растений (БаЪасеае) с клубеньковыми бактериями (ризобиями) из родов ЯЫ1оЫыт, 8тогЫ1оЬшт, Мв10гЫ10Ыыт, БгайугЫ1оЫыт и ряда других. БРС характеризуется образованием корневых симбиотических структур — инфекционных нитей и клубеньков, в которых ризобии размножаются и фиксируют атмосферный азот (N2), превращающийся в процессе биогенеза в доступный растению-хозяину минеральный азот ^Ы3). Изучение симбиоза между ризобиями и бобовыми растениями имеет большое практическое значение для получения высоких урожаев бобовых и других культурных растений, повышения плодородия почвы и сохранения экологической стабильности среды [1].
Формирование БРС осуществляется клубеньковыми бактериями (микросимбионтом) под строгим контролем и участием растения-хозяина (макросимбионта) [2—5]. В этих процессах участвуют сигнальные системы: бактериальная — N0^ факторная (NF) и растительные — кальциевая, НАДФН-оксидазная, NO-cинтазная и их компоненты — Са2+, пероксид водорода (Н2О2) и оксид азота (N0). В настоящее время нет сомнений в том, что ризобиальная NF-сигнальная система играет роль триггера, запускающего генетическую программу в клетках растений по формированию симбиотических структур и реализации азотфик-сирующей функции корневых клубеньков [1, 2]. Однако, путь от инициации NF-сигнальной системы каскада реакций до образования у макросимбионта симбиотических структур до конца не выяснен, поэтому особый интерес представляет роль
активных форм азота (АФА): N0, пероксинитрит (00N0-), N0-, ^О и др. При изучении этого вопроса большое внимание уделяется молекуле-радикалу N0, обладающей широким спектром биологического действия [6, 7]. N0 продуцируется в корнях уже в первые часы после взаимодействия ризобий и растения и обнаруживается в инфекционных нитях, в тканях клубеньковой меристемы и в фиксирующих N клубеньках [8]. Следует отметить, что N0 в растительных тканях может выполнять роль и метаболита, и сигнальной молекулы, и токсичного соединения. Как метаболит она может модифицировать белки (8-нитрозилирова-ние, металлонитрозилирование, тирозиннитрова-ние), как сигнальная молекула — инициировать экспрессию генов и как токсическое вещество — вызывать совместно с активными формами кислорода (АФК) апоптоз клеток.
В предыдущей нашей работе было показано, что в опытах с нитропруссидом натрия — донором N0, ризобиальная инфекция в 4 раза уменьшала содержание этой молекулы в тканях корней этиолированных проростков гороха [9]. Было также показано, что динамика изменения содержания N0 в корнях этиолированных проростков гороха носит пульсирующий характер и характеризовалась как повышением, так и снижением этого показателя [10]. Анализируя эти данные, можно предположить, что образование N0 регулируется механизмом(ами), в котором(ых), по-видимому, участвуют ионы кальция (Са2+). Возможно также имеют место колебательные процессы в химиче-
ских реакциях, объединенных в единую цепь, которые регулируются геномом [11]. Известно, что существует прямое и опосредованное взаимодействие Са2+, NO и Н2О2 в растительных клетках [12, 13]. Однако механизмы, управляющие этими взаимодействиями, до конца не понятны. Более детально изучены механизмы колебаний концентрации ионов Са2+ в цитоплазме, происходящих за счет притока этого элемента из внеклеточного пространства и внутриклеточных органелл и последующего его уменьшения (оттока) из цитоплазмы [14]. Выяснение характера изменений уровня NO в тканях корня растения и оценка генерации NO как автоколебательного процесса, зависимого от других процессов и регулируемого, вероятно, единым механизмом, позволит установить влияние факторов внешней среды на этот процесс.
Цель работы — изучение влияния ионов Са2+ и бактерий Rhizobium leguminosarum bv viceae, различающихся по ^-фиксирующей способности и вирулентности, на динамику изменения содержания NO в корнях проростков гороха.
МЕТОДИКА
Объектом исследований служили проростки гороха посевного (Pisum sativum L., сорт Ямальский), выращенные в пластмассовых кюветах на влажной фильтровальной бумаге при 22°C. Для поддержания заданной температуры использовали электрический термостат с водяной рубашкой ЗЦ-1125М (Россия). Перед замачиванием семена промывали теплой проточной водой с мылом и обеззараживали 3%-ным раствором пероксида водорода в течение 15 мин. После этого семена заливали кипяченной водопроводной водой (60° C) и помещали в термостат для прорастания на 48 ч при 22°C. Для исследований отбирали одинаковые проростки с длиной корней 25—30 мм.
Для изучения действия экзогенного кальция проростки инкубировали в растворе СаС12. Для инокуляции проростков использовали 2 штамма R.. leguminosarum bv viceae: CIAM 1060 (244б) — высокоэффективный азотфиксатор, но обладающий средней вирулентностью и средней конкурентоспособностью (I) [15], и штамм 249б — неэффективный азотфиксатор, но с высокой конкурентоспособностью и вирулентностью (II). Штаммы были получены из коллекции Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии РАСХН (Санкт-Петербург,). Двухсуточные проростки гороха обрабатывали кальцием (100 мкМ) и суспензией (1 мл/корень) бактерий, плотностью 2 х 107 кл./мл.
Содержание NO в тканях корня определяли с помощью флуоресцентного зонда 4,5-диамино-флуоресцеин-диацетата (ДАФ-2ДА) [16]. Корни предварительно инкубировали в средах, содержа-
щих Н2О, СаС12 и суспензию ризобиальных клеток, в течение 10, 20, 30, 40, 50 и 60 мин. Затем отрезки корней (5—15 мм от апекса) инкубировали в 10 мМ трис-НС1-буфере, pH 7.4, содержащем 10 мкМ ДАФ-2ДА, в течение 20 мин на качалке при 26°С. Поперечные срезы (100—150 мкм) отрезков корней использовали для оценки интенсивности флуоресценции на флуоресцентном микроскопе Axio Observer Z1 (Германия) с цифровой монохромной камерой Axio Cam MRm3 и пакетом программного обеспечения для захвата и анализа изображений Axio Vision Rel.4.6. Использовали блок фильтров № 10, длина волны возбуждения 450—490 нм, эмиссия при 515—565 нм. Результаты анализа срезов корней представлены в относительных единицах интенсивности флуоресцентного свечения, выраженных в % от нулевой точки (0 мин), значение которой принималось за 100%.
Содержание общего кальция в корнях проростков через 60 мин экспозиции определяли на атомно-абсорбционном спектрометре модели 403 ("Perkin Elmer", США) в пламени ацетилен-воздух [10]. Результаты представляли как средние арифметические значения 3 независимых экспериментов с указанием стандартной ошибки. Количество анализируемых срезов корней при микроскопических исследованиях — не менее 10. Достоверность различий средних значений оценивали по i-критерию Стъюдента. Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета программ Microsoft Excel.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Содержание NO в тканях корня гороха (Pisum sativum L.) определяли с помощью флуоресцентного зонда ДАФ-2ДА. Это соединение проникает через клеточную мембрану и деацетилируется внутриклеточными эстеразами с образованием 4,5-диаминофлуоресцеина (ДАФ-2), который образует с NO флуоресцирующее соединение — диа-минотриазолфлуоресцеин-триазол (ДАФ-2Т) [16].
На рис. 1 и 2 представлены результаты изучения динамики содержания NO в срезах корней. В контроле четко прослеживались колебания содержания NO: повышение через 10, 30, 50 мин и уменьшение через 20, 40 и 60 мин. Флуктуации наблюдались и при действии экзогенного кальция (100 мкМ СаС12) (рис. 1). Однако зависимость флуктуаций содержания NO от времени в этом случае носила другой характер: повышение уровня NO через 20, 40 и 60 мин и снижение через 10, 30 и 50 мин. Таким образом, экзогенный кальций оказывал влияние на синтез оксида азота, изменяя временную амплитуду его синтеза и сохраняя ритмичность флуктуаций. Надо полагать, что подобное влияние экзогенного кальция связано с
%
мин
Рис. 1. Динамика изменения интенсивности флуоресценции (% от контроля) в корнях этиолированных проростков гороха при инкубациив воде (1) и в присутствии хлористого кальция (2).
%
мин
Рис. 2. Динамика изменения интенсивности флуоресценции (% от контроля) в корнях этиолированных проростков гороха при инокуляции штаммами ри-зобий С1АМ 1060 (1) и 249б (2).
увеличением внутриклеточного и апопластного Са2+. Об этом можно косвенно судить по содержанию общего кальция в корнях проростков гороха через 60 мин экспозиции: 860.3 ± 36 мкг/г сухого вещества в варианте с водой и 1043.5 ± 28 мкг/г сухого вещества в варианте с экзогенным кальцием. То есть, в присутствии СаС12 содержание кальция в тканях корней на 21% достоверно выше, чем в варианте с водой.
При инокуляции проростков ризобиями ритмичность изменения содержания N0 сохранялась, но отличалась от контроля (рис. 1 и 2). При действии эффективного штамма (I) максимумы уровня N0 наблюдались через 10 и 40 мин, минимумы — через 20 и 60 мин. В промежутке между 30 и 50 мин уровень N0 повышался, в то вр
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.