ВЕСТНИК ЮЖНОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА Том 9, № 4, 2013, стр. 78-86
БИОЛОГИЯ
УДК 577.352.38:577.352.336:616-001.11
ВЛИЯНИЕ КАТИОННОГО ПРОИЗВОДНОГО ПЛАСТОХИНОНА -Ю-(6'-ПЛАСТОХИНОНИЛ)ДЕЦИЛТРИФЕНИЛФОСФОНИЯ (SkQ1) -НА ИНТЕНСИВНОСТЬ АПОПТОЗА И СТРУКТУРНОЕ СОСТОЯНИЕ МЕМБРАН ЛИМФОЦИТОВ КРЫС ПРИ ОКИСЛИТЕЛЬНОМ СТРЕССЕ, ВЫЗВАННОМ ГИПЕРБАРООКСИГЕНАЦИЕЙ
© 2013 г. В.В. Внуков1, Н.П. Милютина1, А.А. Ананян1, А.О. Даниленко1,
О.И. Гуценко1, Е.В. Вербицкий2
Поступила 16.01.2013
Исследовано действие 10-(6-пластохинонил)децилтрифенилфосфония (SkQ1) на структурное состояние мембран лимфоцитов и уровень их апоптоза in vivo на модели окислительного стресса у крыс, вызванного воздействием повышенного давления кислорода (экспозиция в течение 90 минут при 0,5 МПа). Обнаружено, что сеанс гипербарооксигенации вызывает заметное накопление молекулярных продуктов липопероксидации в мембранах лимфоцитов, приводящее к изменению их структурных характеристик (повышается микровязкость липидного бислоя и текучесть участков аннулярных липидов, наблюдаются структурные перестройки мембранных белков). Исследование уровня апоптоза лимфоцитов методом проточной лазерной цитофлуориметрии с использованием FITC-меченого аннек-сина V и пропидиум йодида показало более чем двукратное усиление экспрессии фосфатидилсерина на поверхности лимфоцитарных мембран. Применение SkQ1 в крайне малых количествах (50 нмоль/ кг в течение 5 дней) эффективно ингибирует накопление молекулярных продуктов ПОЛ, нормализует структурное состояние мембран лимфоцитов и уровень их апоптоза в условиях физиологической нормы и при окислительном стрессе.
Ключевые слова: SkQ1, гипербарический кислород, лимфоциты, апоптоз, фосфатидилсерин, перекисное окисление липидов, флуоресцентные зонды.
По современным представлениям, к ведущим путям развития апоптоза относят рецепторный и митохондриальный [1, 2]. К настоящему времени накопилось множество доказательств центральной роли митохондрий, интегрирующих различные внутриклеточные сигнальные пути, в запуске апоптоза [3, 4]. Однако наряду со структурно-функциональными изменениями митохондриальных и ядерных мембран при апоптозе наблюдаются нарушения плазматических мембран клеток и их ци-тоскелета [5, 6]. К их числу относятся потеря микроворсинок, межклеточных контактов, блеббинг мембран, экспозиция фосфатидилсерина во внешнем монослое плазматических мембран клеток, вошедших в апоптоз [6]. Экспозиция фосфатидилсерина на поверхности клеток - маркер раннего
1 Южный федеральный университет, 344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Б. Садовая, 105/42, e-mail: natmilut@rambler.ru
2 Южный научный центр Российской академии наук, 344006, г. Ростов-на-Дону, пр. Чехова, 41, e-mail: e_verbitsky@ ssc-ras.ru
апоптоза, который проявляется после блеббинга, но предшествует дезинтеграции мембран и фрагментации ДНК [7]. Этот процесс отражает потерю липидной асимметрии в биомембранах и является сигналом для фагоцитоза апоптотических клеток.
Ранее при исследовании свойств митохондри-ально-адресованных антиоксидантов - катионных производных пластохинона (8кр) - было установлено, что различные формы Бкр (особенно и БкрЯ1) эффективно ингибируют апоптоз и некроз, вызванные перекисью водорода, в клетках ИеЬа и в фибробластах человека [8]. Причем значения С1/2 для подавления апоптоза составляют, соответственно, 1 • 10-11 М и 8 • 10-13 М. В исследовании [9] продемонстрировано, что другие представители мито-хондриально-направленных антиоксидантов, но в значительно больших концентрациях - МкоР (10-6М) и МИоУйЕ (10-6 М) - подавляют Н2О2-индуци-рованный апоптоз в культуре клеток аорты быка путем блокирования выхода цитохрома из мито-
хондрий, ингибирования каспазы-3 и снижения фрагментации ДНК. В исследовании [10] установлено, что МитоР (10-6 М) блокирует Н2О2-индуци-рованный (но не стауроспоринзависимый) апоптоз клеток Jurkat, однако не эффективен как ингибитор апоптоза клеток WEHI 164, вызванного TNF-a.
В данной работе нами исследовано влияние SkQ1 на уровень апоптоза, интенсивность свободноради-кальных процессов и структурное состояние лимфоцитов периферической крови крыс в условиях окислительного стресса, индуцированного гипер-барооксигенацией (ГБО; 0,5 МПа, 90 мин). ГБО использована в данном исследовании как адекватная модель окислительного стресса [11, 12].
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Эксперименты проводили на самцах беспородных крыс Rattus norvégiens массой 180-200 г. Все подопытные животные были разделены на четыре группы по 11-13 животных в группе: первая группа - контроль - интактные животные, содержащиеся в стандартных условиях вивария; вторая группа - крысы, подвергнутые действию ГБО в режиме 0,5 МПа в течение 90 мин (модель окислительного стресса). Подопытные животные помещались в барокамеру объемом 60 л, снабженную щелочным поглотителем углекислоты. После 3-минутной вентиляции чистым кислородом в барокамере создавалось давление 0,5 МПа. Компрессию и декомпрессию проводили со скоростью 0,2 МПа/мин, изопрессия составляла 90 мин. Третью группу составили крысы, которым в течение 5 дней вводили SkQ1 в дозе 50 нмоль/кг в день. Рассчитанную дозу препарата, растворенную в 100 мкл 0,2 %-ного раствора этанола в дистиллированной воде, вводили в защечные мешки животных. Животные контрольной группы получали в течение 5 дней по 100 мкл 0,2%-ного этанола. Четвертую группу составили животные, которым в течение 5 дней вводили 50 нмоль/кг SkQ1 в день, а затем через 1 час после последнего введения подвергали действию ГБО (0,5 МПа, 90 мин).
Материалом для биохимических исследований служила суспензия лимфоцитов, выделенных из цельной крови в градиенте плотности фиколл-верографина (р = 1,077) по методу Boyum [13]. Клетки трижды промывали и суспендировали за-буференным трис-HCl изотоническим раствором хлорида натрия (рН 7,4).
Определение уровня апоптоза лимфоцитов проводили методом проточной лазерной цитоф-луориметрии на цитофлуориметре FACS Canto (Becton Dickinson, USA) c использованием набора Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit 1 (BD
Pharmingen, USA) согласно протоколу фирмы-производителя [14].
Состояние свободнорадикального окисления оценивали по интенсивности накопления молекулярных продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в суспензии лимфоцитов. Экстракцию липидов из суспензии лимфоцитов осуществляли методом Блая и Дайера [15]. Хлороформный экстракт использовали для определения уровня первичных и конечных продуктов ПОЛ. Первичные продукты ПОЛ - диеновые конъюгаты (ДК) - определяли с помощью УФ-спектрофотометрии при максимуме поглощения 232 нм [16]. Содержание конечных продуктов - шиффовых оснований (ШО) - определяли спектрофлуориметрическим методом при длине волны возбуждения 360 нм и максимуме флуоресценции 440 нм [17].
Структурное состояние мембран лимфоцитов исследовали методом латеральной диффузии гидрофобного зонда пирена [18] при концентрации белка в пробе 0,5 мг/мл и конечной концентрации зонда 8 мкМ.
Коэффициент эксимеризации пирена F3/FH, равный отношению интенсивности флуоресценции эк-симеров и мономеров пирена, находится в прямой зависимости от текучести липидного бислоя и в обратной зависимости от его относительной микровязкости [18]. Микровязкость липидного бислоя мембран лимфоцитов FJFU (334) оценивали при длине волны возбуждения 334 нм, а микровязкость зон белок-липидных контактов FJFU (282) - при максимуме возбуждения 282 нм, максимумы длин волн флуоресценции составляли для мономеров пирена 393 нм, для эксимеров 470 нм.
Эффективность переноса энергии электронного возбуждения с триптофановых остатков мембранных белков на пирен оценивали по тушению флуоресценции суспензии лимфоцитов при длине волны возбуждения 282 нм и длине волны флуоресценции 330 нм в отсутствие пирена и после инкубации проб с зондом. Эффективность переноса энергии определяли по выражению
Fe- F Fe ,
где F0 - интенсивность флуоресценции суспензии лимфоцитов в отсутствие пирена; F - интенсивность флуоресценции суспензии лимфоцитов после инкубации с пиреном.
Полярность липидного бислоя и зон белок-ли-пидных контактов мембран лимфоцитов оценивали по соотношению интенсивности флуоресценции двух мономерных форм F372/F393 в тонкой структуре пирена при длинах волн возбуждения 334 нм и 282 нм, соответственно [19].
.60-
40-
&
20-
59,73*
28,42
~28;59**~
16,98*
—I---1— .
Контроль ГБО (0,5 МПа, SkQl ГБО (0,5 МПа, 90 мин) (50нмоль/кг) 90 мин) + SkQl (50нмоль/кг)
Рис. 1. Влияние SkQl на интенсивность раннего апоптоза лимфоцитов периферической крови крыс при ГБО-ин-дуцированном окислительном стрессе. Здесь и на рис. 3, 4:
* - различия с контролем статистически значимы (t-крите-рий, p < 0,05-0,01); ** - различия с группой животных (ГБО; 0,5 МПа, 90 мин) статистически значимы (г-критерий,p < 0,050,01)
Статистическая обработка полученных результатов проводилась с использованием пакетов прикладных программ Statistica 6.0 и Excel 2007. В качестве показателя разброса значений для всех опытов использовали стандартную ошибку среднего значения. Нормальность распределения проверяли с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. Достоверность различий между сравниваемыми группами оценивали с помощью критерия Стью-дента для независимых выборок. Различия считали статистически значимыми прир < 0,05-0,001.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Проведенное исследование показывает, что в условиях ГБО-индуцированного окислительного стресса резко возрастает интенсивность апоптоза лимфоцитов периферической крови крыс, что продемонстрировано с помощью метода проточной цитофлуориметрии. Данный метод позволяет идентифицировать клетки, находящиеся на различных стадиях программируемой клеточной гибели. Внесение в клеточную суспензию двух меток - аннек-сина V-FITC и пропидиум иодида (PI) - позволяет одновременно оценивать количество интактных (аннексин ^негативных/Р1-негативных), ранних апоптотических (аннексин ^позитивных/Р1-нега-тивных) и поздних апоптотических/некротических (аннексин ^позитивных/Р1-позитивных) клеток. Дискриминационный анализ типа клеточной гибели позволил установить, что при окислительном стрессе, индуцированном ГБ
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.