БИОХИМИЯ, 200?, том ?2, вып. 3, с. 338 - 345
УДК 577.355.132
ВЛИЯНИЕ КИСЛОРОДА И РЕАКЦИЙ УГЛЕРОДНОГО ЦИКЛА ФОТОСИНТЕЗА НА КИНЕТИКУ ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНОВИТЕЛЬНЫХ ПРЕВРАЩЕНИЙ П700 В КЛЕТКАХ ЦИАНОБАКТЕРИИ Arthrospira platensis*
© 2007 г. Ю.В. Болычевцева1, И.В. Терехова1, М. Рёгнер2, Н.В. Карапетян1**
1 Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, 119071 Москва, Ленинский пр., 33; факс: (495)954-2732, электронная почта: nkarap@inbi.ras.ru 2 Department of Plant Biochemistry, Biology Faculty, Ruhr-University-Bochum, Bochum 44780, Germany;
E-mail: matthias.roegner@ruhr-uni-bochum.de
Поступила в редакцию 25.07.06 После доработки 14.09.06
Исследовано влияние кислорода и ингибиторов фотосинтеза и дыхания на перенос электрона в фотосистеме 1 (ФС1) клеток цианобактерии Arthrospira platensis. Об окислительно-восстановительных превращениях П700 судили по кинетике индуцируемых светом 730 нм изменений поглощения при 810 нм; для исключения притока электронов от ФС2 измерения проведены в присутствии 30 мкМ диурона. Показано, что ингибиторы терминальных оксидаз (цианид калия и пентахлорофенол) незначительно влияли на быстрое фотоокисление П700 в аэробных условиях, тогда как удаление кислорода существенно замедляло накопление П700+. Отмечено, что при чередовании свет—темнота в отсутствие кислорода медленное фотоокисление П700, наблюдаемое при первом освещении, ускорялось при каждом последующем освещении, что указывает на активацию ферментов углеродного цикла. В этих же условиях пентахлорофенол (разобщитель) существенно ускорял фотоокисление П700. В анаэробных условиях цианид калия, ингибитор ассимиляции углекислоты, не влиял на кинетику окислительно-восстановительных превращений П700, тогда как йодо-ацетамид (ингибитор МАОР(Н)-глицеральдегидфосфатдегидрогеназы) полностью исключал фотоокисление П700. Таким образом, быстрое фотоокисление П700 в клетках A. platensis в аэробных условиях в присутствии DCMU вызвано переносом электронов от ФС1 на кислород, а сложные переходные явления в кинетике фотоокисления П700 в анаэробных условиях (с DCMU) обусловлены участием NADP+, образующегося в реакциях восстановительной фазы цикла Кальвина.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: анаэробиоз, восстановительная фаза цикла Кальвина, ингибиторы, кинетика фотопревращений П700, кислород, NADP+, фотосистема 1.
Цианобактерии как облигатные фототрофы способны к оксигенному фотосинтезу, включающему в себя световую стадию, которая протекает в мембранах при участии двух фотосистем (ФС), и темновую, осуществляемую ферментами углеродного цикла Кальвина [1]. Особенностью цианобактерий является наличие общих компо-
Принятые сокращения: ATP — аденозинтрифосфат; DCMU — 3-(3,4-дихлорфенил)-1,1-диметилмочевина; DBMIB — 2,5-дибромо-3-метил-6-изопропил-р-бензохи-нон; ГАФДГ — глицеральдегидфосфатдегидрогеназа; IAA — йодоацетамид; KCN — цианид калия; PCP — пентахлорофенол; П700 (П700+) — первичный донор электрона фотосистемы 1 в восстановленном (окисленном) состоянии; ПХ — пластохинон; 3-ФГК (1,3-ФГК) — 3-фосфоглицери-новая кислота (1,3-фосфоглицериновая кислота); ФС1 (ФС2) — фотосистема 1 (фотосистема 2).
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 06-197, 26.11.2006.
** Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
нентов фотосинтетического и дыхательного путей переноса электронов — пула пластохинонов (ПХ), цитохромов Ъ6/и цитохрома Ъ553 [2, 3]. При этом пул ПХ может быть восстановлен как ФС2, так и МАОР(Н)-дегидрогеназным комплексом дыхательной цепи, а окисление цитохромов может осуществляться не только ФС1, но и дыхательной цитохромзависимой оксидазой. МАОР(Н), образующийся при линейном транспорте электронов через ФС1, окисляется в ходе различных реакций: в процессе фиксации углекислоты [4], при циклическом транспорте электронов вокруг ФС1 [5, 6], а также при восстановлении кислорода с участием флавопротеинов [7]. Множественность путей переноса электрона в цианобактери-ях затрудняет выяснение механизмов регуляции этого процесса. Кинетика окислительно-восстановительных превращений П700, первичного донора электрона ФС1, будет определяться соотношением реакций притока электронов к П700
от различных источников и оттока электронов к акцепторной части ФС1.
Алкалофильная нитчатая цианобактерия Лг1к-гозрш рШвтю представляет особый интерес для выяснения принципов регуляции фотосинтетической активности, поскольку в связи с ее способностью расти в экстремальных условиях широко используется в биотехнологии [8]. Особенность этой цианобактерии — необычно высокое соотношение ФС1/ФС2, достигающее 5,5 [9], в отличие от такового у высших растений (~1) . Избыточные комплексы ФС1, которые не участвуют в линейном транспорте электрона, функционируют, по-видимому, в циклическом потоке электронов [10].
Цель настоящей работы — выяснение влияния различных процессов переноса электрона на кинетику окислительно-восстановительных превращений П700 у цианобактерии Л. рШгпз1з. В связи с тем что геном этой цианобактерии пока не секвенирован, нет возможности направленно получать мутанты по отдельным кофакторам переноса электрона, как у одноклеточных циано-бактерий ЗупгскосузНз 8р. Поэтому различные пути транспорта электронов в клетках Л. рШгт1з изучали с использованием ингибиторов, действие которых было установлено для других циа-нобактерий. Чтобы исключить влияние образованного ФС2 кислорода на перенос электрона, исследования были проведены в присутствии диурона, который блокирует восстановление пула пластохинонов [11]. Кроме того, создание анаэробных условий позволило удалить кислород как акцептор электронов от ФС1 и с использованием ингибиторов выявить роль реакций углеродного цикла в регуляции окислительно-восстановительных превращений П700.
Показано, что при освещении клеток цианобактерии Л. рШгт1з в присутствии БСМи вклад терминальных оксидаз в отток электронов от цепи переноса незначителен, и кислород является основным акцептором электронов от ФС1. Сложная кинетика фотопревращений П700 в анаэробных условиях отражает влияние реакций восстановительной фазы углеродного цикла фотосинтеза на перенос электрона через ФС1.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Нитчатую цианобактерию ЛНкгозрка (старое название — БртИпа) рШгт1з штамм Р511 культивировали при 30° и интенсивности освещения 30 мкЕ • м-2 • с-1 на модифицированной среде За-рука, рН 9,6 [12], в колбах Эрленмейера (250 мл). В измерениях использовали 6-8-дневные клетки, которые собирали центрифугированием при 3000 об/мин (10 мин) и ресуспендировали в све-
жей среде. Перед измерениями клетки выдерживали в течение 1 ч на свету (20 мкЕ • м-2 • с-1 ).
Фотоиндуцированные изменения поглощения при 810 нм (по сравнению с 870 нм) измеряли с помощью импульсного флуориметра РАМ-101 с двухволновой приставкой ED-P700DW для измерения П700 («Walz», Германия) согласно модифицированной методике [13]. Действующий свет 730 нм интенсивностью 300 мкЕ • м-2 • с-1 или 620 нм интенсивностью 150 мкЕ • м-2 • с-1 получали от фотодиодов («Walz»). Световые кривые окисления П700 измеряли на свету с длиной волны X > 680 нм (максимальная интенсивность составляла 100 мкЕ • м-2 • с-1) от галогеновой лампы с использованием 2-мм фильтров RG 695 («Schott», Германия) и теплового фильтра («Balzers», Лихтенштейн). Для получения света X > 680 нм меньшей интенсивности использовали набор нейтральных фильтров. Все измерения окислительно-восстановительных превращений П700 проводили в присутствии 30 мкМ DCMU при концентрации хлорофилла 20 мкг/мл в кювете толщиной 1 мм. Для установления анаэробиоза в кювете к суспензии клеток A. platensis добавляли глюкозу (10 мМ), глюкозооксидазу (24 ед/мл) и каталазу (400 ед/мл). Затем кювету помещали в термостат (в темноту) при 30°на 10 мин. В этих условиях анаэробиоз устанавливался в течение 5-7 мин и сохранялся в кювете > 40 мин при освещении действующим светом, что было проверено с помощью электрода Кларка (Oxygraph, «Hansatech», Германия). Концентрации использованных ингибиторов (DBMIB, KCN, PCP, IAA) приведены в подписях к рисункам.
Скорость выделения кислорода на свету и поглощения в темноте измеряли при 30° с помощью электрода Кларка (Oxygraph, «Hansatech»); интенсивность действующего света от лампы накаливания составляла 2500 мкЕ • м-2 • с-1; концентрация хлорофилла в ячейке - 30 мкг/мл. Интенсивность ассимиляции углекислоты клетками A. platensis измеряли по скорости включения 14C (из NaH14CO3) в спиртоводораствори-мые продукты фотосинтеза [14].
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Действие ингибиторов фотосинтеза и дыхания на кинетику окислительно-восстановительных превращений П700 в присутствии кислорода. При
освещении клеток Л. рШгпз1з светом 620 нм, поглощаемым обеими фотосистемами, в кинетике фотоокисления П700 в отсутствие БСМи наблюдаются сложные переходные явления: быстрое окисление П700, затем частичное восстановление П700+ за счет притока электронов
от ФС2 и, наконец, медленное окисление П700 до стационарного уровня (рис. 1, а). Сложная кинетика обусловлена соотношением скоростей притока электронов от пула восстановленных ПХ к П700 (через цитохром ¿¿/-комплекс и ци-тохром с553) и оттока электронов от ФС1. Значительный приток электронов от ФС2 к ФС1 в этих условиях не позволяет полностью окислить П700 до уровня, который устанавливается при освещении клеток дальним красным светом 730 нм (рис. 1, а). При преимущественном возбуждении ФС1 (свет 730 нм), которой обогащены клетки А. рШвпз1з [9], наблюдается быстрое накопление П700+. После выключения света П700+ достаточно быстро восстанавливается за счет притока электронов от донорной части ФС1. В случае освещения клеток светом 620 нм скорость темнового восстановления П700+ выше (т1/2 ~50 мс), чем при освещении дальним красным светом (т1/2 ~350 мс), что обусловлено более полным восстановлением пула ПХ за счет ФС2.
Кинетические кривые фотоиндуцированного изменения поглощения при 810 нм клеток А. рШвтю под действием света 730 нм в присутствии и в отсутствие БСМи мало различаются (рис. 1, б). Небольшое ускорение темнового восстановления П700+ в клетках
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.