БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2007, том 24, № 5, с. 402-412
УДК 576.312.6
ВЛИЯНИЕ КИСЛОРОДА НА ТЕЛОМЕРИЗОВАННЫЕ КЛЕТКИ РАЗНОГО ТИПА, ПОЛУЧЕННЫЕ ОТ ОДНОГО ДОНОРА
© 2007 г. М. В. Молдавер, Э. Б. Дашинимаев*, X. С. Вишнякова, П. М. Чумаков, Е. Е. Егоров
Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгелъгардта РАН, 119991 Москва, факс 135-14-05; электронная почта; yegorov@eimb.ru *Московский физико-технический институт, 141700 Долгопрудный, Московская обл., Институтский пер., д. 9 Поступила в редакцию 11.04.2007 г.
Из материала, полученного от одного донора, выделены три первичные культуры клеток: фиброб-ласты кожи (ФК), клетки волосяного сосочка (ВС) и мезенхимальные стромальные клетки из ли-поаспирата (ЛА). С помощью высокоэффективного (лентивирусного) введения гена каталитического компонента теломеразы человека (hTERT) получены штаммы иммортализованных клеток (ФК-hTERT, ВС-hTERT и ЛА-hTERT). Все опыты проводили в атмосфере пониженного содержания кислорода (3%). Перенос теломеризованных клеток в обычные условия (21% кислорода) приводил к замедлению их роста через разные промежутки времени (от 18 до 40 дней). Клетки ФК-hTERT и ВС-hTERT преодолевали это замедление, и через 30-45 дней скорость их роста восстанавливалась и становилась такой же, как и в условиях 3% кислорода. Клетки ЛА-hTERT были не в состоянии восстановить пролиферацию и после нескольких удвоений популяции прекращали размножаться. При изучении колониеобразования выяснилось, что теломеризованные клетки крайне гетерогенны. При редком посеве (примерно три клетки на 1 см2) клетки за 7 дней совершали от 0 до 9 делений. При этом, если средняя скорость роста ФК-hTERT практически не изменялась, то скорость роста клеток ВС-hTERT и ЛА-hTERT заметно ускорялась по сравнению с массовой культурой. Перенос в условия 21% кислорода снижал колониеобразование теломеризованных клеток. Общее количество выросших клеток ФК-hTERT и ВС-hTERT уменьшалось примерно в 3 раза, а ЛА-hTERT - в 6 раз. Исходные клетки (кроме ЛА) хуже теломеризованных переносили переход в атмосферу 21% кислорода. Общее количество клеток всех трех штаммов уменьшалось в 6-7 раз. Обсуждаются возможные причины неспособности клеток ЛА-hTERT адаптироваться к условиям атмосферного кислорода.
В настоящее время ведется много работ, направленных на изучение возможности использования клеточно-замещающих технологий в медицине. В клиниках уже лечат кожные повреждения при помощи культур аутологичных фибробластов и мезенхимальных стволовых клеток [1]. Предполагается, что культуры стволовых клеток можно будет использовать в случае заболеваний самого различного происхождения, связанных с деградацией или повреждением той или иной ткани - инфаркта миокарда, остеохондроза, нейродегенера-тивных заболеваний, ишемических состояний [2].
В последние десятилетия в развитых странах значительно увеличилась средняя продолжительность жизни человека. При старении наступает период, когда клеточных ресурсов организма недостаточно для восполнения естественных потерь. Развиваются дегенеративные синдромы, связанные с потерей клеток. Количество большинства стволовых и прогениторных клеток снижается, и их может не хватать для клеточно-замещающих операций.
К сожалению, получение клеточных культур из первичного материала и поддержание их in vitro
сопряжено с различными трудностями, вызванными не только подбором питательных сред и субстратов. Содержание кислорода в атмосфере (21%) много больше, чем в тканях организма. Уровень кислорода в артериальной крови составляет примерно 15%, в венозной крови - 5%, в ткани хряща - примерно 1%. Повышенное содержание кислорода в условиях in vitro может по-разному сказываться на поведении клеток.
Действие кислорода опосредуется различными механизмами и включает как прямое изменение состояния тиоловых групп всех белков, ведущее к изменению их функций, так и изменение генной активности, вызванное чувствительным к кислороду регулятором транскрипции HIF, проявления токсического (или сигнального?) действия активных форм кислорода, или изменение соотношения окислительного фосфорилирования и гликолиза и, возможно, другие механизмы [3, 4]. В культуре клеток наиболее явно атмосферный кислород проявляет себя, снижая пролиферативные возможности клеток. Считается, что это происходит, прежде всего, из-за повреждения теломер активными формами кислорода [5], основной источник которых -
митохондрии. Чем интенсивнее работает цепь переноса электронов в митохондриях, тем больше выделяется (в виде утечки) активных форм кислорода [6]. В определенных пределах эта утечка должна коррелировать с концентрацией растворенного кислорода.
В 1998 г. было показано, что введение гена каталитического компонента теломеразы (hTERT) способно иммортализовать клетки, позволяя им совершать в культуре неограниченное количество удвоений [7, 8] без каких-либо побочных эффектов теломеризации [9, 10]. Клетки сохраняли нормальные механизмы регуляции пролиферации на протяжении сотен удвоений популяции в культуре, не претерпевая при этом злокачественной трансформации. Единственный фактор, сдерживающий применение теломеризованных клеток в медицинских целях, - опасение, что эти клетки могут вызывать рак, поскольку они содержат активную теломера-зу. Однако стабильность таких клеток очень высока именно из-за постоянной экспрессии теломеразы, а генно-инженерные подходы могут обеспечить временную экспрессию гена и последующее его вырезание [11]. Мы полагаем, что теломериза-ция - это перспективный метод получения необходимых количеств клеток для медицинских целей, а иммортальность этих клеток позволяет проверять возможность активации онкогенов, что невозможно сделать при использовании первичных культур.
Есть данные о том, что мезенхимальные стро-мальные клетки, получаемые из материала липо-аспирата (ЛА) , и клетки волосяного сосочка (ВС) способны дифференцироваться, давая начало костной, хрящевой, жировой, мышечной и, возможно, нервной ткани [12, 13]. Относительно легкая процедура получения этих клеток делает их привлекательными для использования в клеточно-замещающей терапии.
Цель данной работы - изучение возможности теломеризации различных типов клеток человека и подбор необходимых для этого условий.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Клетки. Первичные культуры фибробластов кожи (ФК), клеток ВС и ЛА любезно предоставлены С.М.Тереховым и Е.В. Казимирчук (МГНЦ РАМН). ФК были выделены из биоптата кожи внутренней стороны предплечья по стандартной методике. Клетки ЛА получали по методике [12], а клетки ВС - согласно методике [14]. Все клетки были получены от одного здорового донора - мужчины 45 лет. Клетки культивировали в среде DMEM ("ПанЭко", Россия), содержащей 15% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) ("Ну-С1опе", США) и 40 ед/мл гентамицина при 37°С, в атмосфере, содержащей 5% СО2 и кислород в различной концентрации (3 или 21%). Для изменения
концентрации кислорода клетки культивировали в специализированном термостате ("Therma", США). По достижении монослоя клетки рассевали в 2 раза.
Получение препаратов инфекционных реком-бинантных лентивирусных частиц pLA-CMV-hTERT. кДНК hTERT человека, включающая полную кодирующую область [15], была клонирована под промотор цитомегаловируса (CMV) в лентиви-русный вектор pLU-PL3 [16]. Для упаковки векторных псевдовирусных частиц ДНК лентивирусного вектора вводили в клетки 293Т одновременно с двумя упаковочными плазмидами - pCMV-deltaR8.2 [17] (экспрессирует белок Gag и обратную тран-скриптазу вируса иммунодефицита человека) и pVSV-G [18] (экспрессирует белок G вируса везикулярного стоматита). Три плазмиды смешивали в равном соотношении и вводили в клетки методом липофекции с помощью системы Lipofectamine-plus ("Invitrogen", США) по протоколу, рекомендованному производителем. Сбор вирусных частиц производили в течение 3 сут, начиная с 48 ч после трансфекции, каждые 8 ч. Сразу после отбора ви-рус-содержащие супернатанты помещали на лед и добавляли 10% (v/v) PEG-8000 ("Sigma"). После сбора вируса преципитаты вирусных частиц, образовавшиеся при высаживании полиэтиленгликолем, осаждали низкоскоростным центрифугированием (5000 об/мин, 10 мин) и суспендировали в свежей среде DMEM с добавлением 5% эмбриональной бычьей сыворотки (1/20 от исходного объема суперна-танта). Препарат разделяли на аликвоты и хранили при -70°С.
Введение гена hTERT в клетки человека с помощью pLA-CMV-hTERT. Титр неконцентрированного вируса обычно составляет примерно 3-5 х х 106/мл. После удаления ростовой среды к клеткам, растущим в 25 см2 флаконах, на стадии половины монослоя добавляли вирусный концентрат (1 мл с титром 108/мл), разведенный в соотношении 1:2 полной ростовой средой с сывороткой. Эта смесь содержала также 5 мкг/мл полибрена. Инкубировали в течение ночи, после чего меняли среду на обычную. Экспрессия гена hTERT развивается медленно в течение 3-4 дней.
Колониеобразование осуществляли, как описано в [19]. В пластиковые 10 см чашки Петри ("Costar", США) высевали по 200 клеток (подсчет производили в камере Горяева) и культивировали в среде DMEM ("ПанЭко", Россия), содержащей 20% FBS ("HyClone", США) и 40 ед/мл гентамицина, при 37°С, в атмосфере, содержащей 5% СО2, 3 или 21% кислорода. Через 7 дней клетки фиксировали и окрашивали (70% этанол, 0.1% метиленовый синий).
Подсчитывали число колоний и число клеток в колониях. Под колониями мы понимаем колонии любого размера, в том числе состоящие из одной клетки. Каждую чашку закрепляли на листе бума-
0 10 20 30 40 50
0 30 60 90 120
Время, дни
Рис. 1. Иммортализация фибробластов кожи. а - Кривые роста ФК после трансфекции pLA-CMV-hTERT на уровне шести УП в условиях 3% кислорода. б - Кривые роста ФК-hTERT при переносе в условия 21% кислорода. в - Кривые роста нетрансфицированных ФК при переносе в условия 21% кислорода.
ги с нарисованной сеткой. Изображения анализировали с помощью стереомикроскопа МБС-9 (СССР). На листе бумаги с увеличенным изображением сетки отмечали положение колоний и количество клеток в них. Количество клеток счита-
ли округленно по разрядам двоичной системы. Например, если
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.