научная статья по теме ВЛИЯНИЕ КОМПЛЕКСА ТАФТСИНА С КУКУРБИТ[7]УРИЛОМ НА ГУМОРАЛЬНЫЙ И КЛЕТОЧНЫЙ ИММУННЫЙ ОТВЕТ IN VIVO Биология

ВЛИЯНИЕ КОМПЛЕКСА ТАФТСИНА С КУКУРБИТ[7]УРИЛОМ НА ГУМОРАЛЬНЫЙ И КЛЕТОЧНЫЙ ИММУННЫЙ ОТВЕТ IN VIVO

Пашкина Е. А., Гришина Л. В., Любимов Г. Ю., Козлов В. А.

ФГБУ «НИИ Клинической иммунологии» СО РАМН, Новосибирск, Россия

В эксперименте на лабораторных животных исследовано влияние иммуномодулятора тафтсина, находящегося в комплексе с кукурбит[7]урилом, на параметры клеточного и гуморального звеньев иммунной системы. Предполагалось, что комплексообразование защитит молекулу тафтсина от биодеградации и усилит действие пептида. Установлено, что комплекс эффективнее стимулирует гуморальное звено и обладает аналогичным действием клеточное звено по сравнению со свободным тафтсином в ответ на тимус-зависимый антиген.

Ключевые слова: кукурбит[7]урил, тафтсин, пептиды, комплексообразование

Введение. Пептид тафтсин представляет собой естественный иммуномодулятор, стимулирующий фагоцитоз. Однако действие тафтсина не ограничивается активацией переваривающей активности фагоцитов. Он обладает широким спектром иммуномоду-лирующего действия благодаря изменению биологической активности целого ряда клеток, обладающих рецепторами к нему [1]. Так, тафтсин оптимизирует клеточную кооперацию макрофагов и Т- и В-лимфоцитов, способен усиливать реакции гуморального и клеточного иммунитета.

Однако тафтсин неустойчив к действию некоторых внутренних факторов, поэтому стимулирующий эффект тафтсина в организме кратковременен. В качестве одного из способов защиты молекулы пептида от биодеградации можно применять комплексообразова-ния целевых молекул по типу «гость-хозяин». Известно, что такое комплексообразование пептида с наноразмерным кавитандом кукур-бит[7]урилом способно защитить молекулу от действия пептидаз [2]. Кукурбит[7]урил проявляет низкую токсичность в экспериментах как in vitro, так и in vivo [3], что позволяет использовать его при работе с культурами клеток и лабораторными животными. Ранее нами была определена константа связывания кукурбит[7]урила с тафтсином, которая составила (2,1±0,4)х103 М-1, и было исследовано влияние комплекса на пролиферативную ак-

тивность клеток и продукцию цитокинов [4]. Результаты этих исследований показали, что комплекс обладает более выраженным стимулирующим действием на уровень продукции у-интерферона по сравнению со свободным препаратом, что возможно указывает на защиту кукурбит[7]урилом молекулы тафтсина от гидратации различного рода пептидазами. В связи с этим нам представляется возможным и оправданным дальнейшее изучение иммуномодулирующего действия тафтсина в комплексе с кукурбит[7]урилом.

Целью данной работы явилось определение иммуномодулирующего действия комплекса тафтсина с кукурбит[7]урилом в отношении клеточного и гуморального звеньев иммунного ответа.

Материал и методы. В работе были использованы мыши-самцы гибриды F1 (СВАх С57В1/6) в возрасте 2 мес, полученные из экспериментально-биологической клиники лабораторных животных СО РАМН (Новосибирск). Животных содержали в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите животных, используемых для экспериментальных или иных научных целей (Страсбург, 1986).

Для внутрибрюшинного введения использовались растворы в кукурбит[7]урила (синтезирован в ФГБУ ИНХ СО РАН, Новосибирск) и тафтсина («НПФ ВЕРТА», Россия) в фосфатно-солевом буфере (ООО«Биолот»,

368

Иммунорегуляция

Россия). Проводилась серия опытов, в ходе каждого опыта животные были разделены на группы по 5-6 мышей, которым интрапе-ритонеально трехкратно в течение недели проводили инъекции. Первой группе вводили комплекс тафтсина с кукурбит[7]урилом (25 мкг тафтсина в 0,25 мл 4М раствора кукур-бит[7]урила), второй группе - 25 мкг тафтсина в 0,25 мл буфера, третьей - 0,25 мл 4М раствора кукурбит[7]урила, четвертой - 0,25 мл фос-фатно - солевого буфера.

Для оценки параметров иммунной системы in vivo мышей иммунизировали тимус-зависимым антигеном - 3% раствором эритроцитов барана (ЭБ) внутрибрюшинно в объеме 500 мкл среды RPMI-1640, иммунизация проводилась на следующий день после второго введения препарата и за 2 дня до третьего введения. Определялись параметры гуморального (количество антителообразующих клеток (АОК) в селезенке) и клеточного иммунитета (интенсивность реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ)).

Гуморальный иммунный ответ оценивали на пике ответа - на четвертые сутки (IgM-АОК) по количеству зон гемолиза в жидкой среде [5]. У мышей после забоя дислокацией шейных позвонков изымались селезенки, из которых приготовлялась клеточная суспензия в среде RPMI-1640. Далее готовили инкубационную смесь: 500 мкл клеточной суспензии, 500 мкл комплемента (ЗАО «ЭКОЛаб», Россия) и 500 мкл суспензии ЭБ (12х108 ЭБ/мл). Компоненты перемешивали, смесь заливали в стеклянные камеры, сделанные из двух предметных стекол, склеенных между собой вдоль продольных сторон при помощи смеси воска с парафином. При заполнении смесью учитывали объем камеры. Камеры помещали в термостат и инкубировали при 37 °C в течение 90 минут, после чего подсчитывали зоны гемолиза под бинокулярной лупой по формуле: Абсолют. АОК= (АхВхС) /D, где А - количество АОК на камеру, В - объем клеточной суспензии, С - разведение клеточной суспензии, D - объем камеры.

Клеточный иммунитет оценивали по степени выраженности реакции ГЗТ - по величине отека лапы после введения разрешающей дозы ЭБ предварительно сенсибилизированным животным. На четвертые сутки после иммунизации антигеном вводили разрешающую дозу в виде 50% суспензии ЭБ в RPMI-1640 в объеме 50 мкл под подошвенный апоневроз правой задней лапы. В левую заднюю лапу для контроля вводили среду в том же объеме. Учет реакции проводился через 24 часа во величине местного отека. Объем отека оценивался при помощи штангенциркуля. Результат выражали в относительных (отношение разности между отеком лапки после введения ЭБ и отеком лапки после введения среды к отеку левой лапки) единицах.

Учитывая, что распределение изучаемых параметров отличалось от нормального, статистическую обработку данных проводили с использованием непараметрического и -критерия Манна-Уитни.

Результаты и обсуждение. Усиление гуморального иммунного ответа на ЭБ по сравнению с контролем наблюдалось при введении комплекса пептида тафтсина с кукурбит[7] урилом (см. табл.), в то время как свободный пептид не оказывал влияние наколичество АОК. Кукурбит[7]урил без иммуномодули-рующего пептида не влиял на гуморальный иммунный ответ.

Согласно литературным данным, тафт-син повышает количество АОК при введении в дозе 20мг/кг, в то время как в данном исследовании доза препарата на одну мышь гораздо ниже - 1,25 мг/кг [6]. Соответственно, ком-плексообразование позволяет снизить дозу препарата более чем в 10 раз.

Показано, что и введение комплекса тафтсина с кукурбит[7]урилом, и введение свободного пептида тафтсина повышает выраженность реакции ГЗТ. Достоверных различий между действием комплекса и свободного пептида не обнаружено. Кукурбит[7]урил не влиял на проявление реакции ГЗТ.

Таблица. Показатели количества АОК и выраженности реакции ГЗТ в серии экспериментов in vivo. Данные приведены в виде медианы и квартильного размаха

Контроль Кукурбит[7]урил тафтсин Комплекс

АОК 4909 (2250-9087) 7621 (4704-8628) 7232 (4388-10125) 11966* (8526-157150)

ГЗТ 52,3 (50,0-58,0) 52,0 (50,0-55,5) 60,5 (57,0-66,6) * 57,5 (55,0-64,7) *

Примечание:* достоверные различия по сравнению с контролем.

Из литературных источников следует, что пептид тафтсин усиливает реакцию ГЗТ в дозе 25 мкг/мышь, следовательно, полученные данные соответствуют мировой практике [7]. Различий при развитии клеточного иммунного ответа после иммунизации ЭБ между свободным и находящимся в комплексе пептидом обнаружено не было. Следовательно, ком-плексообразование не изменяет способность тафтсина влиять на интенсивность ГЗТ.

Выводы. Таким образом, в используемой дозе при изученной схеме введения комплекс кукурбит[7]урила с тафтсином стимулирует гуморальное и клеточное звенья иммунной системы в ответ на тимус-зависимый антиген (ЭБ). Комплексообразование не влияет на выраженность клеточного иммунного ответа, и в то же время усиливает иммуномодули-рующие свойства пептида, вызывая повыше-

ние антителообразования. Кукурбит[7]урил в используемой дозе в данном исследовании не проявляет иммуномодулирующих свойств.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Перельмутер В. М., Одинцов Ю. Н., Климен-тьева Т. К. Сибирский онкологический журнал 2004, 4 (12), 57-62.

2. Hennig A., Ghale G., Nau W. M. Chem. Commun. 2007,1614-1616.

3. Uzunova V. D., Cullinane C., Brix K., et al. Org. Biomol. Chem. 2010, 8, 2037-2042.

4. Пашкина Е. А., Щепотина Е. Г., Гришина Л. В. и др. Вестник Уральской медицинской академической науки 2011, 2/2 (35), 50-51.

5. Cunningham A. Nature 1965, 207, 1106-1107.

6. Tzenoval E., Segal S., Stabinsky Y. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1978, 75, 3400-3404.

7. Florentin I., Chung V., Martinez J. et al. Methods Find Exp. Clin. Pharmacol. 1986, 8 (2), 73-80.

EFFECT OF PEPTIDE TUFTSIN COMPLEX WITH CUCURBIT[7]URIL ON THE HUMORAL AND CELLULAR IMMUNE RESPONSES IN VIVO

Pashkina E. A., Grishina L. V., Lubimov G. Y., Kozlov V. A.

FSBI "Research Institute of Clinical Immunology" RAMS SB, Novosibirsk, Russia

In laboratory environment there has been examined the effect of immunomodulator taftsin complexed with cucurbit[7]uril on the cellular and humoral immunity components of laboratory animals. It was assumed that the molecule taftsin complexing protects against biodegradation and enhance the action of the peptide. It has been established that the complex effectively stimulates humoral component and has a similar effect on the cellular component, compared to the free taftsin in response to a thymus-dependent antigen.

Key words: cucurbit[7]uril, taftsin, peptides, complexation

ИММУННЫЕ И ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ НЕВЫНАШИВАНИЯ В УСЛОВИЯХ ЭКСПОЗИЦИИ ГИДРОКСИЛИРОВАННЫМИ БЕНЗОЛАМИ

Предеина Р. А.1, Бубнова О. АЛ2, Вдовина Н.А.1, ВаранкинаА. В.2

ФБУН «ФНЦ медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения»; 2Пермский государ

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.