ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ^^^^^^^^^^^^ СТАТЬИ
УДК 577.352.333+582.282.123.4+581.19-228.212.34
ВЛИЯНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ХЛОРИСТОГО НАТРИЯ В СРЕДЕ НА СОСТАВ МЕМБРАННЫХ ЛИПИДОВ И УГЛЕВОДОВ ЦИТОЗОЛЯ
ГРИБА FUSARIUM SP.
© 2013 г. Е. В. Смолянюк*, Е. Н. Биланенко*, В. М. Терёшина**, А. В. Качалкин*, О. В. Камзолкина*, 1
*Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова **Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук, Москва
Поступила в редакцию 26.04.2012 г.
Мицелиальный гриб Fusarium sp., выделенный из засоленных почв, согласно данным идентификации по региону ITS1-5.8S-ITS2 и D1/D2 доменам LSU рДНК отнесен к видовой группе Fusarium in-carnatum-equiseti. По данным роста на средах с различными концентрациями NaCl тип его адаптации определен как галотолерантный. Механизмы галотолерантности включают накопление в цитозоле пятиатомного нециклического полиола арабита, снижение соотношения стерины/фосфолипиды, рост уровня фосфатидных кислот в составе фосфолипидов и повышение степени ненасыщенности фосфо-липидов, что особенно выражено в идиофазе. Обсуждаются механизмы галоустойчивости мицелиаль-ного гриба Fusarium sp. в сравнении с дрожжами и дрожжеподобными грибами.
Ключевые слова: Fusarium, галотолерантность, липиды, углеводы.
DOI: 10.7868/S0026365613050121
Гиперсоленые местообитания широко представлены в природе гиперсолеными водоемами, засоленными почвами (солонцы, солончаки и др.), местами природной добычи соли, где под действием солнечных лучей происходит ее выпаривание из морской воды. Высокие концентрации солей, в первую очередь хлористого натрия, низкая доступность воды с резкими и случайными ее колебаниями, высокая инсоляция служат лимитирующими жизнь факторами в таких местообитаниях.
Анализ биоразнообразия и экофизиологии грибов засоленных местообитаний показывает присутствие в них галофильных, галотолерантных и галочувствительных видов [1—2]. Галофиль-ные/галотолерантные виды грибов характеризуются устойчивостью и к другим стрессовым воздействиям: к ультрафиолетовой радиации, перепадам температур, экстремальным значениям рН среды, что, по-видимому, может свидетельствовать об универсальном характере ряда механизмов адаптации. Устойчивые к высоким концентрациям солей представители Dothideomycetes показывают большую степень филогенетического родства с обитателями поверхности скал в аридных областях с засушливым климатом, от поляр-
1 Автор для корреспонденции (E-mail: o-kamzolkina@ yandex.ru).
ных регионов до субтропиков [3]. Повышение засоления среды можно рассматривать как двухфак-торный стресс, включающий как осмотическую, так и токсическую составляющую, так как повышенная концентрация ионов во внешней среде ведет, с одной стороны, к дегидратации и потере клеткой тургорного давления, с другой стороны, к повышению внутриклеточной концентрации ионов. Среди известных стратегий галофильных грибов отметим накопление осмотически активных веществ в цитоплазме (осмолитов, или совместимых соединений) для защиты клеток при дегидратации и перестройку состава мембранных липидов для поддержания необходимого динамичного состояния (вязкости) мембран и их функционирования в меняющихся условиях среды [4—6]. Для дрожжевых и мицелиальных грибов в качестве наиболее важных осмолитов показаны многоатомные спирты глицерин, эритрит, арабит и маннит [7]. В качестве универсального протектора, стабилизирующего мембраны при дегидратации, вызванной как высокими концентрациями органических и неорганических соединений, так и тепловым шоком, указывают и трегалозу [8, 9].
Механизмы поддержания водного и ионного гомеостаза активно исследуются на дрожжевых и дрожжеподобных темнопигментированных грибах, во многих исследованиях модельным объек-
595
6*
том служит галофильный вид Hortaea werneckii [10]. В отличие от дрожжевых и дрожжеподобных грибов, механизмы устойчивости к осмотическому и ионному стрессам у мицелиальных грибов исследованы гораздо меньше. Широко распространенные, в том числе и в засоленных засушливых почвах, виды рода Fusarium (F. solani, F. oxy-sporum, F. equiseti, F. chlamydosporum, F. compactum) известны как умеренные галотолеранты [11].
Цель настоящей работы — изучение динамики радиального роста колоний, состава растворимых углеводов цитозоля и мембранных липидов выделенного из засоленной почвы гриба Fusarium sp. при культивировании на средах с разными концентрациями хлористого натрия.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объект исследования — изолят БМ42 Fusarium sp., стерильный (не образующий спор) мицели-альный морфотип, идентификация которого была проведена на основании данных нуклеотидных последовательностей региона ITS1-5.8S-ITS2 и D1/D2 доменов LSU рДНК. Протоколы выделения ДНК, амплификации и секвенирования указаны в предыдущих работах [12, 13]. Полученные нуклеотидные последовательности были депонированы в генбанке NCBI (www.ncbi.nih.gov) и в дальнейшем использованы для проведения филогенетического анализа. Нуклеотидные последовательности близких видов для построения филогенетического дерева были взяты из генбанка NCBI на основании данных недавнего исследования рода Fusarium [14]. Для проведения филогенетического анализа использовали пакет программ MAFFT 6 [15] и MEGA4 [16]. Алгоритм построения филогенетического дерева — максимальная парсимония (MP).
Исследуемый изолят был выделен из образцов почвы с хлоридным типом засоления и значением рН 8.8. Образцы почвы (верхние 0—5 см) хлорид-ного типа засоления были отобраны на побережье Черного моря в районе г. Поморие (Болгария) в местах природной добычи соли.
Гриб выращивали на питательных средах с добавлением NaCl в различных концентрациях. К агаризованной среде с суслом (СА), (сусло 1.8°Б, агар 1.2%), добавляли 1.0, 1.5 и 2.5 М NaCl. Блок с мицелием помещали в центр чашки Петри и культивировали в течение 14 сут в термостате при 29 ± 1°C. Измеряли диаметр колонии каждые 3 сут на протяжении всего периода культивирования. Эксперимент проводили в пяти повторностях. С помощью программы Microsoft Office Excel 2003 полученные данные были обработаны и построен график скорости роста на средах с различной концентрацией хлористого натрия.
Для проведения биохимических исследований микромицет высевали на чашки Петри с питательной средой тремя блоками с мицелием. В работе использовали три типа агаризованных сред: СА, СА с 1 М и 1.5 М NaCl. Гриб культивировали в темноте в термостате при 29 ± 1 °C в течение 7 (логарифмическая фаза роста) и 14 сут (стационарная фаза). Биомассу собирали с поверхности агаризованной среды с помощью скальпеля, промывали дистиллированной водой, просушивали фильтровальной бумагой и хранили при —70°С.
Экстракцию липидов из биомассы гриба проводили методом Николса [17]. Навеску мицелия (около 1 г) растирали с изопропанолом для дезактивации липаз и выдерживали при 70° С в течение 30 мин. Далее остаток экстрагировали двукратно смесью изопропанол : хлороформ (1 : 1) и (1 : 2) в тех же условиях, упаривали на роторном испарителе, липиды растворяли в смеси хлороформ : метанол (1 : 1), для удаления водорастворимых веществ к экстракту добавляли 2.5% раствор хлорида натрия. После разделения смеси на вортексе хлороформный слой сушили пропусканием через безводный сульфат натрия, упаривали и досушивали в вакууме до постоянной массы. Полученный остаток растворяли в небольшом количестве смеси хлороформ : метанол (1 : 1), хранили при - 21 °С.
Состав нейтральных липидов (НЛ) анализировали методом восходящей ТСХ на стеклянных пластинках с силикагелем 60 ("Merck", Германия). Для разделения НЛ пользовались системой растворителей гексан : серный эфир : уксусная кислота (85 : 15 : 1) [18]. В качестве стандарта для количественного определения стеринов использовали эргостерин ("Sigma", США) в количестве 5 и 10 мкг. Для разделения фосфолипидов (ФЛ) и гликолипидов (ГЛ) использовали двумерную ТСХ [19]. На пластинку наносили 100-200 мкг липидов. В первом направлении была использована система I, содержащая хлороформ, метанол и воду (65 : 25 : 4), а во втором — система II, содержащая хлороформ, ацетон, метанол, уксусную кислоту и воду (50 : 20 : 10 : 10 : 5). Гликоцерамиды бычьей сыворотки, использованные в качестве стандарта для сфинголипидов, и фосфатидилхолин для фосфолипидов, наносили на хроматограммы перед их пропусканием во втором направлении. Гликоцера-миды наносили в количестве 5 и 10 мкг, фосфатидилхолин — в количестве 10 и 20 мкг. Хроматограммы опрыскивали 5% серной кислотой в этаноле с последующим нагреванием при 180°С до проявления пятен. Для идентификации ФЛ использовали индивидуальные метчики и качественные реакции с нингидрином (на наличие аминогруппы), реактивом Драгендорфа (на содержащие холин ФЛ) и а-нафтолом (на гликолипиды) [18]. Для установления сфинголипидной природы гликолипидов использовали метод омыления
[18]. Нейтральные липиды идентифицировали с помощью индивидуальных метчиков: моно-, ди-и триацилглицеринов, свободных жирных кислот, стеринов (эргостерина), углеводородов ("Sigma", США). Количественный анализ липидов проводили с использованием компьютерной программы Dens ("Ленхром", Россия) в режиме прямой аппроксимации по калибровочным кривым на основе стандартных растворов фосфатидилхо-лина ("Sigma", США), гликоцерамидов ("Lar-odan", Швеция), эргостерина ("Sigma", США).
Для анализа жирнокислотного состава отдельных фосфолипидов их выделяли хроматографи-чески на двух пластинках, элюировали в течение ночи в смеси хлороформ : метанол (1 : 1). Супер-натант декантировали, выпаривали, добавляли 1 мл толуола и 2 мл 2.5% H2SO4 в метаноле и выдерживали в течение 2 ч при 70°С. Метиловые эфиры жирных кислот экстрагировали гексаном, сушили и анализировали на газожидкостном хроматографе Кристалл 5000.1 (ЗАО "Хроматек", Россия) на капиллярной колонке 0ptima-240-0.25 мкм, 60 м, 0.25 мм ("Macherey-Nagel Gm-bH&Co", Германия). Для хроматографирования применяли температурную программу от 130 до 240°С. Идентификацию проводили с использованием смеси метчиков индивидуальных метиловых эфиров жирных кислот Supelco 37 Component FAME Mix (США).
Дл
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.