МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 1, с. 37-44
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ =
УДК 574.3+579.841.11.[017.6+042]
ВЛИЯНИЕ КОНЦЕНТРАЦИЙ ОСНОВНЫХ БИОГЕННЫХ ЭЛЕМЕНТОВ НА ДИНАМИКУ РОСТА И СОСТАВ ПОПУЛЯЦИИ R-, S- И М-ДИССОЦИАНТОВ PSEUDOMONAS AERUGINOSA И ПУТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ИМИ ГЛЮКОЗЫ: ОКИСЛЕНИЕ И БРОЖЕНИЕ
© 2004 г. Е. С. Милько, И. А. Ильиных
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова Поступила в редакцию 20.12.02 г.
Впервые выявлены закономерности изменения состава популяции монокультур диссоциантов P. aeruginosa в стационарной фазе роста в зависимости от начального содержания основных биогенных элементов в среде. Состав популяции монокультур не меняется на средах с достаточными для роста концентрациями питательных веществ и очень низким их количеством. Изменение состава популяции происходит в условиях дисбаланса основных биогенных элементов в среде: при исходной концентрации нитрата 0.07% или фосфата 0.004-0.0014% на стационарной фазе роста R-диссоциант на 30-40% замещается S, а S-диссоциант на 50-80% замещается M-диссоциантом. Состав популяции М-диссоцианта постоянен в течение всего периода роста. R-диссоциант лучше растет при достаточном для роста содержании глюкозы, нитрата и фосфата в среде, а М-диссоциант - при снижении их концентрации. У R-диссоцианта в динамике роста pH среды меняется мало, и их трех диссоциантов отношение потребленных клетками углерода к фосфору (C/P) минимально во всех вариантах опыта, т.е. у него преобладает окислительный путь использования глюкозы. У М-диссоцианта при росте на глюкозе наблюдается подкисление среды до 3.4-3.9 и отношение поглощенных C/P за время культивирования наибольшее из трех диссоциантов, т.е. у него преобладает брожение. У S-диссоци-анта наблюдается изменение pH и C/P в динамике роста, т.е. происходит переключение с одного пути использования глюкозы на другой.
Ключевые слова: состав популяции, диссоциация, состав среды, динамика роста, Pseudomonas aeruginosa.
Диссоциативные переходы бактерий, или вариация фаз, вносят важнейший вклад в создание гетерогенности бактериальной популяции. Они обусловливаются геномными перестройками, которые происходят с высокой частотой, на несколько порядков превышающей частоту случайных мутаций, и обладают плейотропным действием. Это определяет постоянные и обратимые изменения многих морфологических и физиоло-го-биохимических свойств клеток: способность к деградации и синтезу практически ценных веществ, устойчивость к внешнему воздействию, потребность в питательных веществах.
Под действием меняющихся условий внешней среды, которые являются селектирующими факторами, изменяется соотношение диссоциантов в популяции бактерий, поэтому диссоциация может осложнять исследовательскую работу и обусловливать снижение эффективности применения бактерий, в том числе псевдомонад, в микробиологических производствах за счет появления в популяции неактивных вариантов. В естественных местах обитания процесс диссоциации обеспечивает адаптацию популяций бактерий к внешним
воздействиям и расширяет границы выживаемости вида [1].
Ранее нами с использованием метода полного факторного эксперимента было исследовано влияние углеродного, азотного и фосфорного питания на рост R-, S- и M-диссоциантов Pseudomonas aeruginosa K-2 в стационарной фазе [2]. По полученным данным для каждого из диссоциантов определены концентрации основных биогенных элементов в среде на среднем уровне. Установлено, что при снижении концентрации фосфора в среде происходит изменение состава популяции S-дис-социанта в стационарной фазе роста [3].
В культуральной жидкости М-диссоцианта этого штамма обнаружена муравьиная кислота и показано, что активность дегидрогеназы глюко-зо-6-фосфата М-диссоцианта на два порядка ниже, чем у R- и S-диссоциантов [4]. Мы предположили, что у диссоциантов псевдомонад есть два пути использования глюкозы: окисление и брожение, преобладание каждого из которых можно контролировать по изменению pH среды или по соотношению количества поглощенных клетками углерода и фосфора.
Таблица 1. Содержание в среде (%) для каждого из диссоциантов P. aeruginosa глюкозы (А), нитрата (Б), и фосфата (В)
R S M
№ серии № среды
А Б В А Б В А Б В
I 1 2.0 1.1 0.055 2.0 1.1 0.055 1.0 0.55 0.028
II 2 1.0 0.55 0.028 1.0 0.55 0.028 0.4 0.55 0.028
3 2.0 0.44 0.028 2.0 0.44 0.028 2.0 0.12 0.028
4 2.0 0.55 0.014 2.0 0.55 0.014 2.0 0.55 0.005
III 5 0.2 0.29 0.014 0.2 0.29 0.014 0.2 0.29 0.014
6 0.8 0.07 0.014 0.8 0.07 0.014 0.8 0.07 0.014
7 0.8 0.29 0.004 0.8 0.29 0.004 0.8 0.29 0.004
IV 8 0.07 0.07 0.004 0.07 0.07 0.004 0.07 0.07 0.004
9 0.4 0.02 0.004 0.2 0.02 0.004 0.2 0.02 0.004
10 0.4 0.07 0.001 0.2 0.07 0.001 0.2 0.07 0.001
Цель настоящей работы - исследование влияния концентрации основных биогенных элементов в среде на рост, состав популяции монокультур диссоциантов псевдомонад и пути использования ими глюкозы. Для этого изучали влияние различных начальных концентраций глюкозы, нитрата и фосфата в среде на потребление этих веществ клетками диссоциантов P. aeruginosa в динамике их роста, изменение рН среды и состав популяции бактерий в стационарной фазе.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектами настоящего исследования были R-, S- и М-диссоцианты широко распространенной в природе бактерии Pseudomonas aeruginosa K-2. Штамм выделен из пластовых вод сибирского нефтяного месторождения [5].
Для выращивания исследуемых псевдомонад использовали среды, содержащие следующие компоненты: азотнокислый натрий, натрий фосфорнокислый однозамещенный, хлористый калий, сернокислый магний. Варьировали концентрации (%): глюкозы от 0.07 до 2, нитратов от 0.02 до 1.1, фосфатов от 0.001 до 0.055. Количество остальных веществ было постоянно: хлористый калий -0.06%, сернокислый магний - 0.02%. Состав используемых сред представлен в табл. 1.
Бактерии культивировали в пробирках на 50 мл с 10 мл среды на качалке (180 об/мин) при температуре 30°C. В качестве посевного материала использовали односуточные культуры диссоциантов псевдомонад, выращенные на плотной среде МПБ + сусло (1 : 1), агар 1.5%.
Рост бактерий оценивали нефелометрически по плотности культуры. Плотность инокулята выравнивали по нефелометру до концентрации
клеток 109 в 1 мл. Посевной материал вносили в количестве 3 об. %. Показания нефелометра для удобства расчетов умножали на 100. Соотношение диссоциантов в популяции определяли по морфологии колоний рассевом на агаризованную среду МПБ + сусло.
Величину рН среды измеряли микропотенциометром Checker фирмы "HANNA Instruments". Глюкозу определяли с трифенилтетразолием хлорида [6], азот - с сульфофеноловым реактивом [7], фосфор - методом Пануша, основным на взаимодействии ортофосфата с молибдатом аммония [8].
Каждый опыт повторяли два раза в трех по-вторностях, на графиках и в таблицах приведены средние значения.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Логика работы была построена на выяснении закономерностей изменения состава популяции монокультур диссоциантов P. aeruginosa и путей использования ими глюкозы при поэтапном снижении концентрации основных биогенных элементов (углерода, азота и фосфора) в среде и создании несбалансированных сред. В качестве исходных (серия I) были взяты среды, в которых концентрации основных биогенных элементов снижены в два раза по сравнению с их средним уровнем, определенным ранее [2, 3] для каждого из диссоциантов (табл. 1).
На рис. 1а представлен рост трех диссоциантов и остаточное содержание в среде углерода, азота и фосфора в динамике роста культур на исходной среде (табл. 1, среда 1). Максимальная оптическая плотность наблюдалась у R-диссоцианта, минимальная - у М-диссоцианта. Наиболее интенсивное потребление углерода, азота и фосфора у всех трех диссоциантов совпадало с максималь-
« R
св о
О X е
ч и т п
О
550 450 350 250 150 50 -50
(а)
(2)
§ ч л ^
& § тм
9.6 8.4 7.2
6.0 || 4.8
3.6
уг 2.4 1.2
2.2
а
тг нт мг
е,
Я се
нт оо
W %
S Ч
рм
н *
на, ер
Ш о
a g
ф
1.4
1.0
0.6
0.2 0.32 0.28 0.24 0.20 0.16 0.12 0.08
0.04
R
а
M
J_I_I_I_L_
R
M
_|_I_I_I_I_I_L
О— _|_
M
■■0-<?"0—■~|.........-»--о
550 450 350 250 150 50 -50
6.6
5.4
4.2
3.0
1.8
0.6
-0.6
0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0
90
80 70 60
50 40 30
(б)
R
о-.........
.....X
M
J_I_I_I_L_
-10 0 10 20 30 40 50 60 70 Возраст культуры, ч
-10 0 10 20 30 40 50 60 70 Возраст культуры, ч
Рис. 1. Рост R-, S- и М-диссоциантов P. aeruginosa, и остаточное содержание в среде углерода, азота и фосфора. а - исходная среда (среда < 1); б - среда с пониженной концентрацией углерода (среда < 2); 1 - рост бактерий, 2 -содержание в среде углерода, 3 - содержание в среде азота, 4 - содержание в среде фосфора.
ной скоростью роста и наблюдалось между 16 и 24 ч. В конце культивирования в среде оставалось еще значительное количество неиспользованных ресурсов. рН среды (рис. 2а) у Я-диссоцианта мало изменялся в течение всего культивирования, у Б-диссоцианта - снижался до 5.3; при прекраще-
нии роста (64 ч) и переходе культур в стационарную фазу происходило резкое подщелачивание среды Я и Б диссоциантами до 8.2 и 8.5 соответственно, что связано, вероятно, с автолизом клеток. Быстрая остановка роста М-клеток (20 час) и подкисление среды до рН 3.3 связаны с их способ-
S
pH
10 - (а)
9 - -
8 п - R Я У7 / / -
/ V / s Ч \ "-•с--сг а ^ XT / vy' /
6 - 1-1 ч Ч \ ч Ч ч ^ и / / а г —cf -
5 - \ S -
4 - <х 'О-.......... M -
3 1 1 1 1 ? 1 1 1
10 -
9 (в) _
8 R -
7 О.;-сг \ ^□ -
6 N Ч S S ✓ -
5 ч О г V -
4 Ч>............. _
3 - 1 1 1 1 1 M 1 1 1
0 0 10 20 30 40 50 60 70 - 10
(б)
-□.-□■.о------°
S
о...
M
.........-о—о
_|_I_I_I_L_
(г)
Ьч
"о--
......о M
_|_L_
Возраст культуры, ч
Возраст культуры, ч
Рис. 2. Изменение рН среды в динамике роста R-, S- и M-диссоциантов P. aeruginosa: a - исходная среда < 1, б - среда < 2 с пониженной концентрацией углерода, в - среда < 3 с пониженной концентрацией азота, г - среда < 4 с пониженной концентрацией фосфора.
S
ностью образов
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.