ИЗВЕСТИЯ РАИ. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2007, № 1, с. 102-105
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
УДК 577.1:631.531.19:633.11
ВЛИЯНИЕ КРАСНОГО СВЕТА НА АКТИВНОСТЬ ФОСФОДИЭСТЕРАЗ цАМФ У ФОТОПЕРИОДИЧЕСКИ РАЗЛИЧНЫХ ЗЛАКОВ И ЯРОВИЗИРОВАННОЙ ОЗИМОЙ ПШЕНИЦЫ
© 2007 г. Е. П. Феденко*, Т. А. Кокшарова**
*Институт биохимии им. А.И. Баха РАИ, 117071 Москва, Ленинский просп., 33 **Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет,
119992 Москва, Ленинские горы E-mail: TA_Koksharova@rambler.ru Поступила в редакцию 12.07.2005 г.
В работе показано, что освещение красным светом проростков фотопериодически различных злаков по-разному влияет на активность множественных форм фосфодиэстеразы (ФДЭ) циклического аденозинмонофосфата. Обнаружено, что проведение полной яровизации озимой пшеницы Triticum aestivum L. меняет знак ответа всех форм фосфодиэстеразы на противоположный.
Понимание возможности перехода растений к репродуктивному развитию связано с изучением цепи биохимических процессов, происходящих при выходе этиолированного проростка из почвы на свет. При запуске процессов фотопериодизма и фотоморфогенеза основную роль играет красный свет, рецептором которого в клетке растения является фитохром. Задача изучения фотопериодизма включает в себя две составляющих - биофизическую и биохимическую. Первая связана с функционированием нескольких форм фитохрома. Вторая касается начальных биохимических этапов запуска процесса фотопериодизма. Решению этой второй задачи посвящена наша работа.
Один из путей действия фитохрома связан с функционированием такого вторичного посредника как циклический аденозинмонофосфат (цАМФ), а именно с изменением активности ферментов его обмена - аденилатциклазы (Феденко и др., 1983) и фосфодиэстеразы (Феденко и др., 1988а, б; Ка-сумов, 1988; Касумов и др., 1991). Это приводит к изменению концентрации цАМФ, а затем через белки, связывающие его и цАМФ-зависимые про-теинкиназы, к изменению экспрессии генома (Яворская и др., 1987) и далее к осуществлению процессов фотоморфогенеза (Феденко и др., 1995).
Для того чтобы понять, каким образом фитохром участвует в процессах фотопериодизма, одним из проявлений которого является способность растения переходить к генеративному развитию при определенной длине дня, целесообразно выяснить реакцию на возбуждение фитохрома красным светом множественных форм ФДЭ, выделенных из проростков фотопериодически различных растений - пшеницы (растения длинного дня (ДД)) и кукурузы (растения короткого дня (КД)). Пере-
ход растений мягкой пшеницы Triticum aestivum L. к цветению контролируется системами генов развития - генами яровизации Vrn и генами фотопериодизма Ppd. В то же время известно, что озимая форма мягкой пшеницы способна переходить к репродуктивному развитию только после полной яровизации и только на длинном дне. Ранее было обнаружено (Фещенко, 1992; Фещенко и др., 1992), что неяровизированные растения озимой пшеницы из-за некомпетентности апекса к воздействию гиббереллина и на длинном дне остаются на вегетативной стадии развития. Эти физиологические данные привели к представлению о том, что функционирование генов Vrn и Ppd взаимосвязано (Агамалова и др, 1987; Подольный и др., 1990).
В связи с этим целесообразно было выяснить, как отвечают множественные формы ФДЭ на освещение проростков озимой пшеницы красным светом до и после яровизации. В данной работе красный свет был использован как аналог длинного дня поскольку его краткое воздействие, как и длинный день, ускоряет развитие ДД растений и тормозит развитие КД растений.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектом исследования служили 5-суточные этиолированные проростки кукурузы Zea mays L. (сорт Днепропетровская) и мягкой пшеницы Triticum aestivum L.: озимой (сорт Эритроспермум 998), яровой (сорт Московская 21) и рекомбинантной формы двуручки, полученной в генерационных расщеплениях от скрещивания указанных сортов пшеницы (Агамалова и др., 1987). Яровизацию наклюнувшихся семян озимой пшеницы проводили в темноте при 4°C в течение 60 сут. Срезанные
5-суточные проростки яровизированной и неяро-визированной озимой пшеницы освещали в течение 4 мин красным (661 нм) светом, полученным с помощью монохроматора. Интенсивность света составляла 100 эрг/cм2с.
Для выделения ФДЭ проростки гомогенизировали в предварительно охлажденной ступке в среде А (1 : 2 вес : объем), содержащей 10 мМ mpuc-HCl рН 7.4, 2 мМ MgCl2, 2 мМ дитиотреитол. Гомоге-нат фильтровали через 8 слоев марли и центрифугировали при 70000 g в течение 30 мин. Надоса-дочная жидкость содержала растворимую ФДЭ. Ее использовали для дробного фракционирования фермента сульфатом аммония. При насыщении соли от 0 до 50% осаждалась первая фракция (ФДЭ I), при насыщении от 50 до 80% осаждалась вторая фракция (ФДЭ II). Белок осаждали центрифугированием при 15000 g в течение 20 мин. Обе фракции диализовали против среды А в течение 20 ч с двукратной сменой раствора. Все процедуры проводили при 4°C в темной комнате при слабом освещении зеленым светом.
Определение активности ФДЭ проводили по методу (Elks et al., 1983) в среде следующего состава: 0.02 мМ цитратный буфер pH 5.6 или mpuc-HCl буфер pH 7.6, 5 мМ MgCl2 (для ФДЭ II), 0.1 мМ 3', 5'-цАМФ "Reanal", 10 мкл/мл 3H-3', 5' цАМФ, (Ленинград, 28 кю/ммоль). Конечный объем 50 мкл.
Инкубацию ФДЭ кукурузы проводили при 45°С, ФДЭ пшеницы - при 30°С в течение 30 мин (ФДЭ I) и 10 мин (ФДЭ II). После инкубации ФДЭ к каждой пробе добавляли по 20 мкл нейтрализующей смеси (0.25 М mpuc-HCl и 0.5 N NaOH, рН 8.0) и по 10 мкл змеиного яда ("Sigma", США) из раствора 1.2 мг/мл 10 мМ трис-HCl; инкубировали 10 мин при 37°С. Реакцию останавливали кипячением в течение 1 мин на водяной бане. Объем каждой пробы доводили водой до 200 мкл.
Весь объем каждой пробы наносили на колонки с ДЭАЭ-сефадексем А-25 и элюировали 1.5 мл бидистиллята прямо во флакон. Радиоактивность элюата определяли на жидкостном сцинтилляци-онном счетчике "Intertechnique" (Франция).
Активность фермента выражали в наномолях аденозина, образующегося в результате двух последовательных реакций, катализируемых фос-фодиэстеразой растений и затем 5'-нуклеотида-зой змеиного яда. Общее содержание белка определяли по методу Лоури (Lowry et al, 1951).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
При освещении проростков кукурузы красным светом увеличивается активность трех форм ФДЭ-ФДЭ I "щелочной", ФДЭ II "кислой" и "щелочной". Активность ФДЭ I "кислой" при этом снижается (таблица).
В проростках яровой и неяровизированной озимой форм пшеницы, а также двуручки, три формы ФДЭ (ФДЭ I "кислая" и "щелочная", ФДЭ II "щелочная") активируются и одна форма (ФДЭ II "кислая") ингибируется красным светом (таблица).
Степень активации различных форм ФДЭ красным светом различна и колеблется от 1.03 до 1.28 у кукурузы, и более значительно (от 1.16 до 3.73) у пшеницы. Для яровой пшеницы отмечена высокая (7.05) степень ингибирования ФДЭ II "кислой" красным светом. Это почти в 6 раз больше снижения активности ФДЭ II "кислой" у двуручки и озимой неяровизированной пшеницы (таблица).
Согласно физиологическим данным, яровая пшеница (Угп Угп Ррё Ррф) представляет собой нейтральное в отношении длины дня растение. Наличие в ее генотипе доминантного гена Ррё дает ей возможность развиваться не только на длинном, но и на коротком дне, что приводит к гибели яровой пшеницы при ее осеннем посеве, так как только в ювенильном состоянии растение может пережить низкие зимние температуры.
В таблице приведены две серии данных для влияние красного света на активность "щелочной" ФДЭ II в проростках двуручки: высокие значения активности соответствуют сезонному пику активности этого фермента и сопровождаются слабым влиянием красного света на его активность (степень ингибирования 1.03); данные для этой формы ФДЭ вне пика ее активности выявляют более существенное действия красного света (степень активации 1.22).
Двуручка (Угп Угп ррёррф) отличается от яровой пшеницы рецессивным состоянием генов ррё, полученные ею от озимого сорта. Двуручка демонстрирует пониженную степень активации "кислой" и "щелочной" форм ФДЭ I по сравнению с исходными родительскими формами, в то время как степень ингибирования ФДЭ II "кислой" у нее значительно уступает яровой пшенице (почти в 6 раз) и почти такая же, как у озимой пшеницы (таблица).
Увеличение под воздействием красного света активности обеих форм ФДЭ I и "щелочной" ФДЭ II у озимой пшеницы {угп угп ррй ррф) в неяровизированной форме заметно меньше, чем у яровой пшеницы. Ингибирование активности "кислой" ФДЭ II у неяровизированной озимой пшеницы, также как у двуручки, примерно в шесть раз меньше, чем у яровой пшеницы. Здесь, возможно, сказывается рецессивное состояние генов ррё у двуручки и озимой пшеницы.
Таким образом, растения короткого и длинного дня характеризуются различным ответом множественных форм ФДЭ на красный свет, причем только "кислые" формы ФДЭ кукурузы и мягкой
104
ФЕДЕНКО, КОКШАРОВА
Влияние красного света на активность (нмоль аденозина/мг белка мин) множественных форм ФДЭ фотопериодически различных растений и яровизированной озимой пшеницы
Отношене к длине дня ФДЭ I
Растение Генотип pH 5.6 pH 7.6
Т Кр. К Т Кр. К
Кукуруза КД 6.02 4.41 1.36(-) 3.61 3.72 1.03(+)
Яровая пшеница Vrn Vrn Ppd Ppd НД 0.33 0.74 2.25(+) 0.33 0.60 1.84(+)
Двуручка Vrn Vrn ppd ppd ДД 97.7 129.0 1.32(+) 99.5 115.4 1.16(+)
Озимая пшеница vrn vrn ppd ppd ДД 0.22 0.45 2.05(+) 0.42 0.74 1.76(+)
неяровизированная
Озимая пшеница vrn vrn ppd ppd ДД 1.31 0.00 0(-) 3.03 2.44 1.24(-)
яровизированная
Отношене к длине дня ФДЭ II
Растение Генотип pH 5.6 pH 7.6
Т Кр. К Т Кр. К
Кукуруза КД 3.09 3.97 1.28(+) 1.22 1.53 1.25(+)
Яровая пшеница Vrn Vrn Ppd Ppd НД 1.41 0.20 7.05(-) 0.24 0.88 3.73(+)
Двуручка Vrn Vrn ppd ppd ДД 375.9 313.3 1.20(-) 275.9 0.43* 267.8 0.52* 1.03(-) 1.22*(+)
Озимая пшеница vrn vrn ppd ppd ДД 0.44 0.37 1.19(-) 0.38 0.52 1.37(+)
неяровизированная
Озимая пшеница vrn vrn ppd ppd ДД 1.08 1.88 1.44(+) 1.94 1.38 1.41(-)
яровизированная
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.