МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 84, № 5, с. 553-560
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
ВЛИЯНИЕ ЛЕКТИНОВ АЗОСПИРИЛЛ НА АКТИВНОСТЬ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ И ИХ ИНГИБИТОРОВ В КОРНЯХ ПРОРОСТКОВ ПШЕНИЦЫ © 2015 г. С. A. Аленькина1, В. Е. Никитина
Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов, Россия
Поступила в редакцию 13.04.2015 г.
Показано, что лектины двух штаммов азоспирилл — А10$рт11ит Ъгаяйете $р7 (эпифит) и АхозртПыт ЪгаяИете $р245 (эндофит), оказывали различное воздействие на активность кислых (рН 3.5), нейтральных (рН 6.8) и щелочных (рН 7.8) протеиназ. Лектин А. Ъгаяйете $р7 вызывал снижение про-теолитической активности при всех значениях рН, в то же время лектин А. ЪгаяИете $р245, напротив, оказывал активирующее действие на активность ферментов за исключением кислых протеиназ, активность которых оставалась неизменной. Использование ингибиторов протеаз позволило сделать вывод о том, что лектины изучаемых штаммов А. Ъгаяйете обуславливают изменение соотношения активностей различных типов протеаз в прорастающих зерновках. Установлено увеличение трипси-нингибирующей активности в корнях проростков пшеницы в присутствии изучаемых лектинов. Полученные в работе результаты свидетельствуют о более широком, чем считалось ранее, спектре влияния лектинов азоспирилл на метаболизм растения-хозяина и в сочетании с уже имеющимися сведениями позволят внести коррективы в представления о механизмах взаимодействия бактерий с растениями при формировании ассоциации.
Ключевые слова: ризосфера, ассоциативная азотфиксация, азоспириллы, лектины, корни проростков пшеницы, протеиназы, ингибиторы трипсина.
DOI: 10.7868/S002636561505002X
Ассоциативные азотфиксирующие бактерии рода Azospirillum — PGPR (plant growth-promoting rhizobacteria) микроорганизмы, стимулирующие рост растений. Считается, что ростстимулирую-щий эффект бактерий связан со способностью к азотфиксации, к продукции фитогормонов, солю-билизации фосфатов, с улучшением водного и минерального статуса, с продукцией ряда соединений, увеличивающих мембранную активность и пролиферацию тканей корневой системы, а также со способностью уменьшать влияние стрессоров на растение и осуществлять контроль многочисленных фитопатогенов (Baldani, Baldani, 2005; Bashan et al., 2004; Alen'kina et al., 2006). К механизмам биоконтрольного эффекта азоспирилл относится способность индуцировать у растений защитные реакции, направленные на повышение устойчивости (Bhattacharyya, Jha, 2012). Несмотря на активно ведущиеся в этой области исследования, на данный момент вопрос о приоритетности какого-либо из перечисленных факторов, объясняющих благоприятное влияние инокуляции азотфиксиру-
1 Автор для корреспонденции (е-mail: alenkina@ibppm.sgu.ru).
ющими бактериями на рост и продуктивность растения, остается открытым.
Образование азотфиксирующих систем, как и любых других биологических межклеточных взаимодействий, согласно современным представлениям, включает функционирование молекул белковой природы — лектинов. Долгое время считалось, что в системе углевод-белковых взаимодействий при формировании азотфиксирующих ассоциаций и симбиозов роль узнающих молекул выполняют лектины растений (Антонюк, Евсеева, 2006). Однако появление новых знаний относительно лектинов азотфиксирующих бактерий заставило внести коррективы в систему взглядов на лектин-углеводные взаимодействия, реализуемые при возникновении азотфиксирующих ассоциаций, где учитывается роль бактериальных лектинов (Castellanos et al., 1998; Никитина и соавт., 2005).
Никитина и соавт. (1996) показали присутствие на поверхности клеток азоспирилл лекти-нов, вовлеченных в бактериальную адгезию к корням. С поверхности двух отличающихся по способу колонизации растений штаммов ассоци-
ативных азотфиксирующих бактерий — A. brasilense Sp7 и A. brasilense Sp245, были изолированы лектины, являющиеся гликопротеинами с различными молекулярными массами и углеводной специфичностью (Никитина и соавт., 2005, Шелудько и соавт., 2009). Было показано, что лектины азоспирилл являются полифункциональными молекулами. Помимо адгезивной функции, они способны влиять на метаболизм растительной клетки — стимулировать прорастание семян (Никитина и соавт., 2004), проявлять по отношению к растительной клетке митоген-ную и ферментмодифицирующую активности (Alen'kina et al., 2006; Чернышева и соавт., 2005), изменять содержание стрессовых метаболитов в растительной клетке, что свидетельствует о способности лектинов выступать в качестве индукторов адаптационных процессов в корнях проростков пшеницы (Alen'kina et al., 2014).
Как известно, в защитно-приспособительные реакции растений на действие неблагоприятных факторов внешней среды вовлечены многие физиологические и биохимические процессы (Титов и соавт., 2006; Трунова, 2007).
Важную роль в обмене веществ живого организма и защите его от повреждения играют про-теолитические ферменты. Они, контролируя концентрацию белков и пептидов, участвуют в модификации и устранении биополимеров, уже не выполняющих (или выполняющих не в полной мере) в этих условиях необходимые организму функции. Также протеолитические ферменты обеспечивают клетку мономерными субстратами для синтеза стрессовых (шоковых) белков, являющихся важным фактором устойчивости клеток (Тарчевский, 2001).
В настоящее время установлено, что в процессах защиты растений от действия различных неблагоприятных факторов важная роль принадлежит ингибиторам протеолитических ферментов, на что указывается в работах многих авторов (Lawrence, Koundal, 2002; Фролова, Титов, 2008; Домаш и соавт., 2008).
Целью данной работы была оценка влияния лектинов A. brasilense Sp7 и A. brasilense Sp245 на активность протеаз и их ингибиторов в корнях проростков пшеницы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Микроорганизмы и условия культивирования.
Объектом исследования служили два штамма азотфиксирующих ассоциативных бактерий рода Azospirillum — A. brasilense Sp7 (эпифитный), полученный из Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН (г. Москва), и A. brasilense Sp245 (эндофитный) из коллекции микроорганизмов ИБФРМ РАН.
Получение препаратов лектинов. Выделение лектинов с поверхности клеток и очистку проводили ранее описанными способами (Никитина и соавт., 1996).
Стерилизация семян, получение корней проростков и предобработка корней препаратами лектинов. Семена пшеницы Triticum aestivum L. сорта "Саратовская 29" (ГНУ НИИ Сельского хозяйства Юго-Востока РСХА, Саратов, Россия) были поверхностно стерилизованы в 70% (об/об) этаноле 1 мин, отмыты стерильной водой. Для получения корней проростков семена были выращены в асептических условиях в чашках Петри на стерильной дистиллированной воде.
Корни после экспозиции с препаратами лектинов (концентрации лектинов 5—40 мкг/мл, максимальное время инкубации — 1 ч), гомогенизировали в 0.15 М фосфатном буфере (рН 7.8). Го-могенат центрифугировали при 7000 g, надоса-дочную жидкость использовали для определения протеолитической активности и активности ингибиторов.
Определение концентрации белка. Количество белка определяли по методу Бредфорд (Bradford, 1976).
Определение протеолитической активности.
Протеолитическую активность определяли по методу Ансона (Гильманов и соавт., 1981). В качестве субстрата при определении кислых протеи-наз использовали 0.5% раствор гемоглобина ("Sigma", США) в цитратно-фосфатном буфере с рН 4.5. При определении протеолитической активности нейтральных и щелочных протеиназ использовали 0.25% казеин ("Sigma", США) на цит-ратно-фосфатном буфере (рН 6.8 и 7.8). Инкубационная среда содержала 0.1 мл гомогената корней, 0.1 мл субстрата, 0.1 мл буфера.
Для исследования влияния ингибиторов про-теаз на активность ферментов в инкубационную среду добавляли ПХМБ (я-хлоромеркуриобен-зойная кислота) ("Sigma", США), ЭДТА (этилен-диаминтетрауксусная кислота) ("Sigma", США), ФМСФ (фенилметилсульфонилфторид) ("Sigma", США) в конечной концентрации 1 х 10-3 М, пепстатин - 2 х 10-5 М ("Sigma", США). Пробу выдерживали 1 ч при 37°С, после чего определяли остаточную активность. Остаточную активность выражали в процентах, принимая за 100% (контроль) активность фермента в отсутствие ингибиторов в реакционной смеси.
Определение активности ингибиторов трипсина. Ингибиторную активность оценивали по подавлению активности трипсина (Ермаков и соавт., 1987). Использовали кристаллический трипсин фирмы "Serva" (Германия). Трипсинингибирую-щую активность выражали в мг чистого трипсина, инактивированного ингибитором на г сырой массы корней.
Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку проводили с использованием критерия Стьюдента. На рисунках приведены средние арифметические значения по трем независимым опытам, проведенным в 5-кратной биологической повторности, и их стандартные ошибки. В статье обсуждаются величины, достоверные при Р < 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Определение уровня влияния лектинов А. ЬгазИете 8р7 и А. ЬгазИете 8р245 на протеолиз в корнях проростков пшеницы проводили при нескольких значениях рН, что позволило оценить влияние лектинов на активность различных про-теиназ. Согласно данным, представленным на рис. 1, лектин А. ЬгазИвтв 8р7 вызывал падение активности протеиназ при всех значениях рН. Наиболее значительным эффект оказался в отношении кислых и щелочных ферментов. Самыми эффективными ингибирующими концентрациями лекти-на при всех значениях рН явились 10 и 20 мкг/мл. Для кислых протеиназ наибольшее ингибирова-ние наблюдалось при 15 мин инкубирования, для нейтральных протеиназ для всех временных промежутков активность ферментов не отличалась, для щелочных — наибольший ингибирующий эффект был отмечен при 15 и 30 мин воздействия лектина (рис. 1).
Лектин А. ЬгазИвтв 8р245 оказывал противоположный эффект. Наблюдалось повышение активности нейтральных и щелочных протеиназ через 15 мин действия лектина, достигая максимального значения после 30 мин инкубации. Для нейтральных ферментов повышение активности под влиянием лектина было более существенным. Наиболее эффективной в обоих случаях оказалась концен
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.