ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 50, № 3, с. 318-323
УДК 579.24+579.222
ВЛИЯНИЕ ЛИГНИНА И КИСЛОРОДА НА РОСТ И ЛИПИДООБРАЗОВАНИЕ Lentinus tigrinus
© 2014 г. А. А. Ивашечкин*, Я. Э. Сергеева*, В. В. Лунин**, ***, В. И. Богдан**, ***,
И. С. Мысякина*, Е. П. Феофилова*
*Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва, 117312 **Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН, Москва, 119991 ***Химический факультет, Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, 119991
e-mail: feofilov@inmi.host.ru, biolog100@bk.ru Поступила в редакцию 13.08.2013 г.
При выращивании мицелиального гриба Lentinus tigrinus на среде с лигнином повышенное содержание кислорода стимулировало рост гриба и увеличивало выход липидов. В составе фосфолипидов впервые обнаружено высокое содержание фосфатидной кислоты и уменьшение уровня фосфатидил-этаноламина и фосфатидилсерина. В составе нейтральных липидов происходили изменения в соотношении этерифицированных и свободных стеринов: количество эфиров стеринов уменьшалось, одновременно снижалось содержание свободных жирных кислот. На основании полученных данных обсуждается возможная роль фосфатидной кислоты как вторичного мессенджера, в процессе потребления лигнина грибом Lentinus tigrinus.
DOI: 10.7868/S0555109914030246
Лигнин является вторым по распространенности природным полимером и составляет до одной трети от всей растительной биомассы [1]. Современный анализ литературных данных показывает, что лигнин используется недостаточно в технологических процессах — всего около 70 млн т в год. В настоящее время встает вопрос о возможности расширения использования лигнина как в биотехнологических разработках, так и в "белой химии". Использование основано на данных о способности базидиальных грибов, в частности белой гнили, разлагать лигнин. Однако несмотря на то, что изучением деградации лигнина дереворазрушаю-щими грибами занимаются с 18 столетия, в этом процессе остается много неясного, что и является, вероятно, причиной крайне ограниченного использования лигнина в биотехнологии.
При воздействии грибов на стенки клеток древесины одновременно происходят два процесса — разрушение целлюлозы и лигнина, причем оба эти процесса тесно взаимосвязаны. Была предложена схема, отражающая этапы биодеградации целлюлозы и лигнина под влиянием грибов белой гнили [2, 3]. Имеющиеся в литературе данные о деградации лигноцеллюлозных субстратов позволяют заключить, что процесс разрушения целлюлозы изучен значительно лучше, а предполагаемые схемы деградации лигнина иногда носят гипотетический характер [4]. Кроме того, в настоящее время неизвестно, каков состав лигно-литических и целлюлозолитических ферментов у базидиомицетов, при этом известно, что их соотно-
шение видоспецифично. Изучение биодеградации лигнина грибами затруднено также и тем, что в опытах практически не используют нативный лигнин, а природный биоматериал (древесные опилки, подсолнечная лузга и т.д.), т.е. растительные клеточные стенки, содержащие не только лигнин, но и другие природные биополимеры, поэтому используемый субстрат может значительно повлиять на полученные результаты.
В последние годы появились данные об особой роли простейшего фосфолипида — фосфатидной кислоты (ФК) в сигнальном ответе клетки в условиях стресса и ее участии в перекисном окислении липидов [5]. Известно, что при действии стресса останавливаются ростовые процессы и резко меняется метаболизм клетки. При этом может происходить истощение запаса антиоксидан-тов и начинаются процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ). Именно в этот период происходит образование вторичных мессенджеров в сигнальной системе клеток, среди которых основная роль отводится именно ФК. Таким образом, липидный состав клеток при росте на определенном субстрате, например лигнине, может свидетельствовать о физиологическом состоянии клеток, т.е. знание липидного состава позволяет предположить, в каком состоянии энантиостаза или гомеостаза находится культура гриба, растущего на данном субстрате, и подвержен ли он действию свободно-радикального окисления.
В связи с этим несомненный интерес вызывает предложенная еще в 1995 г. гипотеза А.Н. Капича
о свободно-радикальном окислении лигнина [6]. В результате нарушения в идиофазе регуляции ПОЛ и истощении запаса собственных антиокси-дантов происходит образование высокоактивных радикалов, которые воздействуют одновременно не только на липиды гриба, но и на лигнин, разрушая этот биополимер и превращая его в более доступную форму углеродного субстрата для гриба. Таким образом, активированные формы кислорода возможно также участвуют в разложении лигнина. Полагают, что генерированные ОН—-радикалы делают ароматическую структуру лигнина более чувствительной к действию ферментов грибов, в частности лакказы [7]. В настоящее время известно, что проникновение ферментов-деструкторов лигноцеллюлозы через клеточную стенку затруднено и это заставило обратить внимание на активные формы кислорода — синглетный кислород и гидроксирадикалы [8]. Эту теорию в определенной степени подтверждают данные о взаимосвязи между скоростью деградации лигнина и повышенной аэрацией при культивировании дерево-разрушающих грибов [9]. На примере Stropharia rugosoannulata было установлено, что в условиях твердофазной ферментации деградация лигнина ускоряется в присутствии кислорода, однако опыты проводили на природных лигноцеллюлоз-ных субстратах.
Цель работы — исследование связи между составом липидов, в частности появлением ФК, и ростом гриба на лигнине при различных условиях культивирования — в условиях повышенной и пониженной концентрации кислорода в среде.
МЕТОДИКА
Объекты исследования. В работе основные исследования проводились с базидиальными грибами — Lentinus ^ппш ВКМ F-160 и Stereum М^-^ ВКМ F-1449.
При проведении скрининга грибов на способность разрушать лигнин использовали также Kuehneromyces mШaЫUs, Ceraporia viridians, Шп-cium corolloides, Pleurotus ostreatus, полученные от И. А. Решетниковой из музея грибных культур кафедры микологии и альгологии МГУ им. М.В. Ломоносова.
Условия проведения скрининга. При проведении скрининга использовали природные лигно-целлюлозные субстраты: сосновые опилки (СО) и лузгу подсолнечника (ЛП). При использовании СО твердофазную ферментацию проводили на 4 вариантах сред. Для получения среды СО-1 к 5.0 г опилок добавляли 40 мл водопроводной воды и стерилизовали при 1 атм. Среду СО-2 готовили аналогично СО-1 с предварительным измельчением опилок; среду СО-3 — аналогично СО-1 с предварительной обработкой опилок ультразву-
ком в течение 5 мин; СО-4 — аналогично СО-1 с предварительной глубокой заморозкой СО в течение 5 сут с последующим оттаиванием при комнатной температуре. Опыты проводили в чашках Петри, куда помещали обработанные соответствующим образом СО, 12—15 мл жидкой питательной среды с нитратом аммония [10], лишенной источника углерода, и посевной мицелий испытуемого гриба.
В опытах с другим природным лигнинцеллю-лозным субстратом ЛП предварительно выдерживали в водопроводной воде в течение 1 сут при комнатной температуре. Далее ЛП помещали в чашку Петри, вносили 5—20 мл стерильной воды (ЛП-1) и 0.5% глюкозы в качестве "затравки" — стимулятора метаболических ферментов (ЛП-2).
Культивирование на жидких питательных средах. При культивировании гриба контролем служила питательная среда с нитратом аммония [10] и глюкозой (5.0%). В опытных вариантах глюкоза была заменена на лигносульфонат натрия (2%, содержание лигнина в препарате более 60%), взятом в эквивалентном по углероду количестве. Кроме того, в ряде опытов для ускорения роста мицелия, интенсификации ростовых процессов и индукции лигнолитических ферментов, дополнительно к лигносульфонату натрия вносили "затравку" 0.5% глюкозы. Культивирование проводили при температуре 27°С в течение 8 сут. Глубинное культивирование проводили на круговой качалке (250 об/мин) в колбах на 250 мл с 50 мл питательной среды. Поверхностное культивирование проводили в стационарных условиях в стеклянных матрасах объемом 1 л с 250 мл питательной среды.
Экстракция липидов. Экстракцию липидов из влажной биомассы проводили по методу Фолча [11], их количество определяли гравиметрически.
Определение качественного и количественного состава индивидуальных фракций липидов. Состав фракций нейтральных липидов (НЛ) и полярных липидов (ПЛ) анализировали методом восходящей тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинках с закрепленным слоем силикагеля фирмы "Merck" (Германия). Для разделения НЛ использовали системы растворителей: гексан—диэтило-вый эфир—уксусная кислота (85 : 15 : 1) или петро-лейный эфир—диэтиловый эфир—уксусная кислота (80 : 20 : 2) [12]. Для разделения ПЛ использовали двухмерную ТСХ, последовательно в одном направлении систему хлороформ—метанол-вода (65 : 25 : 4), во втором—хлороформ— ацетон—метанол—уксусная кислота—вода (50 : 20 : : 10 : 10 : 5) [13]. На пластины наносили 70—120 мкг липидов.
Идентификацию фракций проводили с использованием стандартных препаратов липидов, а также по специфическим качественным реак-
циям на отдельные функциональные группы [12]. С этой целью использовали: реактив Драгендорфа, раствор нингидрина, раствор а-нафтола, смесь серной и уксусной кислот. В качестве универсального проявителя использовали раствор фосфорно-молибденовой кислоты.
После идентификации липидных фракций для определения их количественного содержания проводили денситометрический анализ с использованием программ "Dens" и "Sorbfil" (Россия). В качестве стандартов для построения калибровочных кривых использовали стандартные растворы фос-фатидилхолина (ФХ), триацилглицеринов (ТАГ) и свободных жирных кислот (СЖК) ("Sigma", США).
Определение качественного и количественного состава жирных кислот. Для анализа жирных кислот получали их метиловые эфиры, для чего ли-пиды подвергали кислотному метанолизу, как описано в работе [12]. Контроль за ходом реакции осуществляли методом микротонкослойной хроматографии в системе гексан—диэтиловый эфир-уксусная кислота (80 : 20 : 1). Качес
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.