БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2013, том 30, № 1, с. 52-58
УДК 601.2:577.115
ВЛИЯНИЕ ЛИПИДОВ И ИХ МЕТАБОЛИТОВ НА РЕГУЛЯЦИЮ ВЫБРОСА ЯДРА ИЗ ЭРИТРОЦИТОВ ГОЛУБЯ
© 2013 г. А. А. Девяткин*, И. В. Сюсин, В. В. Ревин
Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева, 430000, Саранск, ул. Большевистская, 68;
*электронная почта: arkdev@yandex.ru Поступила в редакцию 01.02.2012 г.
Показано, что при воздействии экзогенных фосфолипидов и их производных на эритроциты голубя происходит выброс ядра из них и образование безъядерных эритроцитов. При этом изменяются не только морфологические показатели, но также количественное и качественное распределение мембранных фосфолипидов. Предполагается, что изменения, происходящие в липидной фазе мембран эритроцитов, являются одним из механизмов подготовки к выбросу ядра и вступлению клеток на путь клеточной гибели.
Ключевые слова: эритроциты, выброс ядра, фосфолипиды.
DOI: 10.7868/S0233475512050039
Программируемая гибель клеток, или апоптоз, представляет собой управляемый процесс самоуничтожения клеток. Апоптоз направлен на освобождение от старых или наработанных в избытке клеток, а также от клеток, у которых нарушена дифференцировка и поврежден генетический материал. Обновление форменных элементов крови, в том числе эритроцитов, происходит весьма интенсивно, и одним из пусковых механизмов является изменение химического состава клетки [1]. Важнейшими эффекторами и регуляторами, участвующими практически во всех физиологических процессах, происходящих в клетке, являются липиды [2, 3]. В качестве вторичных мессен-джеров они передают внутрь клетки различные внешние сигналы, а также действуют как межклеточные медиаторы [4]. Предполагается, что некоторые липиды и их производные играют определенную роль в запуске процессов клеточной гибели [5-8].
В представленной работе изучена роль экзогенных и мембранных липидов в морфологических и биохимических изменениях эритроцитов голубя.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектом исследования служили кровь и эритроциты крови голубя. В качестве индукторов клеточной гибели использовали фосфолипиды, жирные кислоты и диацилглицерин, которые вводили в кровь голубя in vitro в различных концентрациях. Для ингибирования каталазной и пе-
роксидазной активности кровь, стабилизированную гепарином, инкубировали с КСМ (0.5 мМ). Для оценки морфологических изменений ядра эритроцитов окрашивали по методу Май-Грюн-вальда и анализировали микроскопически [9]. Изменения морфологических характеристик эритроцитов оценивали с использованием микроскопа Люмам Р8 с компьютерной регистрацией данных. Фотографии анализировали, обсчитывая по 100 полей зрения для каждого образца. Для изучения биохимических изменений эритроциты отделяли центрифугированием, отмывали физиологическим раствором. Липиды экстрагировали согласно методу Блайя—Дайера [10]. Жирные кислоты метилировали с помощью раствора трехфтористого бора в метаноле [11]. Для изучения качественного и количественного распределения фосфолипидов липиды фракционировали методом тонкослойной хроматографии на пластинках размером 6 х 6 см, в системе Брокхьюза [12]. Фракции фосфолипидов идентифицировали с использованием значений специфических окрашивающих реагентов, а также свидетелей. Относительное содержание отдельных фракций фосфолипидов определяли по содержанию неорганического фосфора [13]. С целью определения изменений в жирнокислотном составе отдельных фракций фосфолипиды делили препаративно на пластинках 20 х 10 см, экстрагировали смесью хлороформ : метанол = 2 : 1. Содержание жирных кислот анализировали на газожидкостном хроматографе Хроматек Кристалл 5000 : 1 с программированием температуры от 170 до 225°С. Статисти-
й
3 «
э -s «
Й О
н
Ü2
о
Е & н р
5 л
6 1
m
6 12 Время инкубации, ч
24
Рис. 1. Влияние сфингомиелина на клеточную гибель эритроцитов при 40°С.
■ — количество безъядерных эритроцитов без добавления сфингомиелина; □ — при добавлении сфингомиелина в концентрации 10-4 моль/л; □ — при добавлении сфингомиелина в концентрации 10-3 моль/л.
Рис. 2. Морфологические изменения эритроцитов голубя при клеточной гибели. а — безъядерные эритроциты; б — стадия выброса ядра. Окраска мазков эозином метиленовый синий по Май-Грюнвальду, х1000.
ческую обработку результатов проводили с использованием IBM IP2 — электронных таблиц Microsoft Excel 2000 и пакета программ STAT2.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В качестве индукторов клеточной гибели использовали сфингомиелин, фосфатидлилсерин, диацилглицерин, а также стеариновую и олеиновую кислоту. Изменения морфологии эритроцитов зависели как от концентрации, так и от температуры и длительности воздействия индукторов. Инкубация крови при температуре 40°С в присутствии сфингомиелина в концентрации 10-4 моль/л в течение 3 ч приводила к изменению морфологии эритроцитов — к появлению безъядерных эритроцитов (рис. 1). Через 24 ч количество безъядерных эритроцитов возрастало в 5 раз. С увеличением концентрации сфингомиелина до 10-3 моль/л процесс становился более интенсивным, а количество безъядерных эритроцитов (в этих же временных интервалах) в 2 раза большим, чем при использо-
вании 10-4 моль/л сфингомиелина. При 40°С интенсивность процессов была настолько высокой, что сложно было фиксировать динамику морфологических изменений эритроцитов. Поэтому, чтобы четче зарегистрировать отдельные стадии клеточной гибели, провели серию опытов, в которых температуру инкубации снизили до 25°С. Через 3 ч инкубации со сфингомиелином в концентрации 10-4 моль/л обнаружили не только безъядерные эритроциты (рис. 2а), но и эритроциты на стадии выброса ядра (рис. 2б). Механизм выброса ядра по характеру напоминал "почкование", т.е. клетка выбрасывала отросток, содержащий ядро (рис. 2б, рис. 3). Клеточная оболочка после отделения органоида восстанавливалась. Эритроциты, лишенные ядра, имели несколько меньшие размеры, чем полноценные клетки (рис. 2а). Повышение длительности воздействия и концентрации сфингомиелина увеличивало количество безъядерных клеток.
3
0
3
После инкубации определяли содержание сфингомиелина, чтобы убедиться в его встраивании в эритроциты. Через 15 мин после внесения сфингомиелина в концентрации 10-4 моль/л в кровь, его содержание в эритроцитах возросло по отношению к контролю на 6% и составило 19.6% от общего количества фосфолипидов. Однако после инкубации в течение 24 ч содержание сфинго-миелина было меньше, чем в контроле, почти 2 раза. Из этих результатов видно, что гидролизу подвергается не только экзогенный сфингомие-лин, но и "собственный" сфингомиелин эритроцитов (рис. 4).
Возможно, проникновение сфингомиелина в эритроциты активирует сфингомиелиновый цикл, в результате чего как экзогенный, так и собственный сфингомиелин гидролизуются до церамида и фосфатидилхолина нейтральной сфингомиелина-зой. Продукты сфингомиелинового цикла (цера-мид и сфингозин) обладают ярко выраженным проапоптическим действием [14—18]. В результате ферментативного гидролиза церамида в клетке накапливается сфингозин. Церамиды ингибиру-ют пролиферацию и стимулируют клеточную гибель [19]. Гидролиз сфингомиелина приводит к изменению свойств мембраны и служит предпо-
сылкой к блеббингу мембраны и образованию везикул на поверхности клеток [20].
Под действием другого физиологически активного фосфолипида — фосфатидилсерина — возникали сходные морфологические изменения, однако доля эритроцитов, подверженных клеточной гибели, была меньше. Внесение в кровь фосфатидилсерина в концентрации 10-5 и 10-4 моль/л не приводило к образованию безъядерных эритроцитов, однако, при концентрации 10-3 моль/л обнаруживались эритроциты в момент выброса ядра и без ядра. Максимальное количество безъядерных клеток зафиксировано после инкубации в течение 24 ч (рис. 5). Результаты нашей работы показывают, что в контроле доля фосфатидилсерина в эритроцитах составляла 5.6% от общего количества фосфолипидов и практически не менялась в течение 24 ч (рис. 6). В то же время содержание фосфа-тидилсерин в опытной пробе через 12 ч было в 2.2 раза, а через 24 ч в 3.4 раза выше, чем в контроле. Таким образом, фосфатидилсерин, добавленный в кровь, как и сфингомиелин связывался с эритроцитами, встраивался в клетки, индуцируя в них морфологические изменения, свойственные апоптозу.
Одной из причин инициации процесса клеточной гибели под действием высоких концен-
% 50
40
30
20
10
0.25
36
Время инкубации, ч
24
Рис. 4. Относительное содержание сфингомиелина (СМ) от общего количества фосфолипидов в эритроцитах голубя при инкубации крови с СМ. ■ — изменение содержания сфигномиелина без добавления сфингомиелина; □ — при добавлении сфингомиелина в концентрации 10-4 моль/л; □ — при добавлении сфингомиелина в концентрации 10-3 моль/л.
8 <ч * о о я ан л.я s ни рн
е
" о
я
t«
m
е б я
Ч о
m о н
иа Я m
0 о |н о
m g
к
0.018 0.016 0.014 0.012 0.010 0.008 0.006 0.004 0.002 0
12
Время, ч
24
Рис. 5. Влияние фосфатидилсерина (ФС) в концентрации 10 3 моль/л на динамику образования безъядерных эритроцитов при 25°С.
0
траций фосфатидилсерина является, возможно, х
резкое увеличение заряда мембраны, что прово- б
цирует изменение свойств бислоя и, как след- н
ствие, запускает механизм программируемой п клеточной гибели.
и
Согласно опубликованным данным, биологи- о
ческими эффекторами физиологических и био- с
химических процессов, в том числе клеточной гибели, могут быть не только и не столько липиды, но и их производные и продукты распада [21—23]. Прежде всего, это относится к диацилглицерину и свободным жирным кислотам. Вклад последних определяется прежде всего степенью насыщенности жирных кислот. Поэтому в качестве моделей
%
20 15 10
1.6
12 24
Время выдержки, ч
Рис. 6. Относительное содержание фосфатидилсери-на (ФС) от общего количества фосфолипидов в эритроцитах голубя при инкубации крови с ФС. ■ — изменение содержания фосфатидилсерина без добавления фосфатидилсерина; □ — при добавлении фосфатидилсерина в концентрации 10-3 моль/л.
1.4
1.2
1.0
§ Î H H
о о
S s рр
m и
3 E 0.8 tS h к о ре еч ц s 0.6
S *
t« о
8 и
VO
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.