МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 1, с. 62-67
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ =
УДК 579.262.633.358
ВЛИЯНИЕ ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ И ГЛЮКАНОВ ДВУХ ШТАММОВ RHIZOBIUM LEGUMINOSARUM BV. VICIAE НА ФОРМИРОВАНИЕ И ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИХ СИМБИОЗА С РАСТЕНИЯМИ ГОРОХА
© 2004 г. А. Ф. Антипчук1, Л. В. Косенко
Институт микробиологии и вирусологии Национальной академии наук Украины, Киев
Поступила в редакцию 14.11.02 г.
В условиях вегетационных опытов изучали влияние липополисахаридов (ЛПС), глюканов (ГЛ) и их неразделенных комплексов (ЛПС-ГЛ) на нодуляционную активность ризобий и эффективность их симбиоза с растениями гороха. В работе использовали два штамма Rhizobium leguminosarum bv. vici-ae, различающиеся по симбиотическим свойствам: штамм 31 (fix+, эффективный, средневирулент-ный, среднеконкурентоспособный) и штамм 2486 (fix-, неэффективный, высоковирулентный, высококонкурентоспособный). Установлено, что препараты ЛПС-ГЛ комплекса и изолированного из него ЛПС высоковирулентного штамма 2486 повышали нодуляционную активность обоих штаммов на 10-26%. Такие же препараты менее инфекционного штамма 31 подобным действием не обладали. При этом неразделенные ЛПС-ГЛ комплексы указанных штаммов повышали продуктивность растений, бактеризованных эффективным штаммом на 18-23% и не изменяли ее у растений, инокулированных неэффективным штаммом-антиподом. Существенного влияния препаратов ЛПС на продуктивность симбиоза не выявлено. Глюканы обоих штаммов увеличивали клубенькообразо-вание у высоковирулентного штамма на 36-56%. Кроме того, обработка глюканом штамма 2486 усиливала азотфиксацию корневых клубеньков растений, бактеризованных штаммом 31, на 27%. В целом, влияние препаратов высоковирулентного, но неспособного к фиксации азота штамма 2486, на формирование и эффективность симбиоза Rhizobium leguminosarum bv. viciae с растениями гороха было большим, чем препаратов средневирулентного, но азотфиксирующего штамма 31.
Ключевые слова: Rhizobium, липополисахарид, глюкан, бобово-ризобиальный симбиоз.
Ризобии синтезируют богатый комплекс клеточных и внеклеточных гликополимеров, которые контролируют процесс установления взаимоотношений этих бактерий с растением-хозяином на разных стадиях формирования бобово-ризоби-ального симбиоза. Внеклеточные гликополиме-ры - экзополисахариды (ЭПС) и капсулярные полисахариды принимают участие на самых ранних, до-контактных стадиях кооперирования партнеров.
К поверхностно локализованным клеточным полисахаридам ризобий относят липополисахари-ды (ЛПС) и (хито)липоолигосахариды.
Несмотря на клеточную локализацию [1], ли-по-олигосахариды при формировании симбиоза играют роль внеклеточных сигнальных молекул. Под действием веществ фенольной природы, выделяемых растением-хозяином, они в небольшом количестве экскретируются из клеточной мембраны ризобий и служат специфичными индукторами программы нодульного органогенеза (Nod-факторами) [2].
В противоположность липоолигосахаридам, два других клеточных полисахарида: ингредиент
1 Адресат для корреспонденции (e-mail: cenoz@serv.imv.kiev.ua).
клеточной стенки ЛПС и связанный с ним глюкан, расположенный в периплазматическом пространстве, выполняют свои симбиотически важные функции как внутриклеточные компоненты бактерий [3-5].
Хотя установлена способность некоторых бактерий выделять ЛПС в окружающую среду [6], однако, по современным представлениям, при кооперировании симбиотических партнеров ЛПС так же, как и Коё-фактор, детерминирует специфичность формирующейся системы, но на более поздних стадиях ее развития [7]. Кроме того, в симбиотическую компетентность ризобий вносит свой вклад глюкан. При этом ризобиальной клетке недостаточно обладать способностью синтезировать глюкан. Необходимо, чтобы он транспортировался через плазматическую мембрану в пе-риплазматическое пространство клетки [5].
Поэтому для изучения главной функциональной роли ЛПС и периплазматического глюкана можно использовать ЛПС-дефектные и глюкано-дефектные мутанты ризобий. Однако, учитывая способность бактерий выделять эти гликополи-меры в окружающую среду, необходимо иметь больше сведений об их биологической активнос-
ти по отношению как к бактериям, так и к растениям. Таких данных крайне мало [8-11].
Ранее нами была исследована роль ЭПС в реализации нодуляционной активности ризобий гороха и формировании бобово-ризобиального симбиоза [12-14].
Целью настоящей работы было изучение влияния клеточных полисахаридов - ЛПС и глюкана на нодуляционную активность бактерий и эффективность симбиоза в системе: растения гороха -Rhizobium leguminosarum bv. viciae.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Бактерии. В работе использовали два штамма Rhizobium leguminosarum bv. viciae (микросимбионты гороха) : штамм 31, fix+, эффективный, средневирулентный, среднеконкурентоспособный (Украинская коллекция микроорганизмов, Институт микробиологии и вирусологии НАН Украины, г. Киев) и штамм 248б, fix-, неэффективный, высоковирулентный, высококонкурентоспособный (коллекция Rhizobium Всероссийского института сельскохозяйственной микробиологии, г. С. Петербург-Пушкин).
Получение препаратов ЛПС и глюкана. Бактерии выращивали при 26-28°С в течение трех суток на бобовом агаре, содержащем 1% маннита. Бактериальную массу смывали физиологическим раствором и клетки бактерий осаждали центрифугированием при 5500 g 40 мин, промывали 5 раз физиологическим раствором и сушили ацетоном и эфиром. Выделение ЛПС выполняли по методу Westphal, Jann [15]. Для удаления кислых экзогли-канов и нуклеиновых кислот полученный препарат обрабатывали 2%-ным цетавлоном в 0.5 М растворе NaCl. Поскольку ЛПС у ризобий обычно ассоциирован с периплазматическим глюканом, ЛПС-глюкановый комплекс подвергали ультрацентрифугированию при 105000g (3 раза по 5 ч). Препараты ЛПС (осадок) и глюкана (надосадочная жидкость) сушили лиофильно.
Вегетационные опыты проводили с растениями гороха (Pisum sativum L.) сорта Уладовский юбилейный в условиях песчаной культуры при поддержании влажности на уровне 60%.
Перед заполнением сосудов крупнозернистый речной песок многократно промывали и прокаливали. Дренажом служила гравийная крошка. В качестве питательного субстрата использовали среду Гельригеля, содержащую 0.1 нормы минерального азота (0.6 мМ Са^03)2 ■ 4H2O) .
Поверхностную стерилизацию семян проводили концентрированной серной кислотой в течение 5 мин., многократно промывали стерильной водопроводной водой и проращивали на голодном агаре в чашках Петри. Откалиброванные
трехсуточные проростки гороха выдерживали в инокуляционной суспензии 1 ч, после чего высаживали в вегетационные сосуды емкостью 1 кг.
Для инокуляции использовали двухсуточную культуру бактерий, отмытых от ЭПС. К клеточной суспензии добавляли в зависимости от варианта опыта, препараты ЛПС, глюкана или их неразделенный комплекс. Конечная концентрация препаратов указанных полисахаридов в 1 мл инокуляционной суспезии составляла 1.5 мг, титр клеток - 1 х 109. Растворы полисахаридов предварительно подвергали тепловой обработке (80°С, 1 ч). Каждый вариант опыта проводили в 8 повторно-стях. Результаты учитывали через 35 суток при достижении растениями фазы стеблевания-начала бутонизации.
Азотфиксируюшую активность определяли аце-тилен-редуктазным методом [16], содержание азота в зеленой массе - микрометодом Кьельдаля [17]. При пересчете на белок использовали коэффициент 6.25.
Статистическую обработку данных проводили по Доспехову [18]. В таблицах представлены средние данные.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Для изучения биоэффекторной активности клеточных полисахаридов ризобий в настояшей работе использовали два контрастных по симбио-тическим свойствам штамма Я. leguminosarum ъу. У1С1ае.
При постановке опытов нами были использованы как неразделенные ЛПС-глюкановые комплексы обоих штаммов, так и препараты ЛПС и глюканов, отделенные друг от друга.
ЛПС указанных штаммов были охарактеризованы нами ранее [19]. В них входят нейтральные сахара-глюкоза, галактоза, манноза, фукоза, рам-ноза, (арабиноза штамм 31); уроновые кислоты -глюкуроновая и галактуроновая; аминосахар глю-козамин и неидентифицированные аминосоедине-ния; 2-кето-3-дезоксиоктоновая кислота (КДО). Препараты глюкана по данным газожидкостной хроматографии и аналитических методов не содержали других сахаров, кроме глюкозы.
Проведенные исследования показали (табл.1), что обработка клеток инокулята препаратом ЛПС-глюканового комплекса высоковирулентного штамма 2486 вызывала увеличение нодуляционной активности обоих испытуемых штаммов. Среднее количество корневых клубеньков в варианте бактеризации штаммом 31 было больше на 26%, чем в контроле, и в варианте со штаммом 2486 - на 10% . Вместе с тем, под действием ЛПС-глюканового комплекса штамма 31, характеризуюшегося меньшей вирулентностью, нодуляционная способность
Таблица 1. Влияние полисахаридов ЛПС-глюканового комплекса R. leguminosarum bv. viciae на образование клубеньков и их азотфиксирующую активность
№ п/п Штамм-иноку-лянт Варианты инокуляции Клубеньки Азотфиксирующая активность
Количество Средняя масса 1 клубенька, мг мкмоль С2Н4/рас-тение х ч мкмоль С2Н4 1 г клубеньков х ч
штук/растение в % к контролю
1 31 Нативная культура без добавления 57 100 161 1.1 3.4
полисахаридов
2 » ЛПС-глюкановый комплекс шт. 31 60 105 156 0.7 2.3
3 » ЛПС-31 47 82 143 0.8 2.6
4 » Глюкан-31 48 84 133 0.7 3.0
5 » ЛПС-глюкановый комплекс шт. 2486 72 126 185 1.3 3.6
6 » ЛПС 2486 64 112 189 1.1 3.0
7 » Глюкан-2486 51 89 185 1.4 3.6
8 2486 Нативная культура без добавления 90 100 Не опреде- 0 0
полисахаридов ляли
9 » ЛПС-глюкановый комплекс шт. 2486 99 110 » 0 0
10 » ЛПС-2486 96 107 » 0 0
11 » Глюкан-2486 122 136 » 0 0
12 » ЛПС-глюкановый комплекс шт. 31 91 101 » 0 0
13 » ЛПС-31 95 106 » 0 0
14 » Глюкан-31 140 156 » 0 0
15 Без инокуляции 0 0 0 0 0
Примечание. Здесь и в таблице 2 препараты обозначены по номерам штаммов.
обоих представителей Я. leguminosarum Ъу. viciae практически не изменялась.
Влияние отдельных компонентов ЛПС - глю-канового комплекса на процессы клубенькообра-зования было р
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.