МИКРОБИОЛОГИЯ, 2011, том 80, № 1, с. 18-23
УДК 582.282.23:577.15.04
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
ВЛИЯНИЕ m-ХЛОРКАРБОНИЛЦИАНИДФЕНИЛГИДРАЗОНА НА СИНТЕЗ НЕОРГАНИЧЕСКИХ ПОЛИФОСФАТОВ SACCHAROMYCES CEREVISIAE
В РАЗНЫХ УСЛОВИЯХ РОСТА
© 2011 г. В. М. Вагабов, Л. В. Трилисенко1, О. Ю. Кочеткова, |А. П. Ильченко, И. С. Кулаев
Учреждение Российской академии наук Институт биохимии и физиологии микроорганизмов
им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино Поступила в редакцию 08.04.2010 г.
Изучено влияние разных концентраций протонофорного разобщителя m-хлоркарбонилцианидфе-нилгидразона (ХКЦФ) на синтез неорганических полифосфатов (полиР) в течение первых 0.5 ч их гиперкомпенсации у дрожжей Saccharomyces cerevisiae ВКМ Y-1173, растущих в среде с 2% глюкозы при низкой (гипоксия) или высокой аэрации, или в среде с 1 об. % этанола при высокой аэрации. Показано, что 5 мкМ концентрация ХКЦФ полностью тормозила рост дрожжей, выросших на этаноле, а 25 мкМ ХКЦФ — выросших на глюкозе независимо от аэрации среды. Максимальная скорость поглощения О2 обнаружена у клеток, выросших на этаноле при 2 мкМ ХКЦФ, на глюкозе при высокой аэрации — при 5 мкМ, на глюкозе в условиях гипоксии — при 25 мкМ ХКЦФ. Действие ХКЦФ выражалось в снижении общего уровня АТР и суммы полиР и неравномерно сказывалось на синтезе отдельных фракций полиР. ХКЦФ больше всего ингибировал синтез наиболее активно образуемых фракций: при росте на глюкозе в условиях гипоксии — полиР1, при росте на глюкозе в условиях аэрации — полиРШ, и при росте на этаноле — полиРШ и полиРУ ХКЦФ не оказывал сколько-нибудь значительного влияния на синтез фракций полиРП и полиР1У, образование которых, по-видимому, в меньшей степени связано с градиентом электрохимического потенциала ионов Н+.
Ключевые слова: неорганические полифосфаты, источник углерода, аэрация, т-хлоркарбонилциа-нидфенилгидразон, дрожжи, Saccharomyces еегеу1$1ае.
Неорганические полифосфаты (полиР), линейные полимеры, состоящие из остатков ортофосфор-ной кислоты, соединенных богатой энергией фос-фоангидридной связью. Они выполняют в клетках многочисленные функции, включая резервирование фосфата и энергии, формирование в комплексе с поли-р-оксибутиратом мембранных каналов, регуляцию экспрессии генов, поддержание необходимого уровня катионов и формирование структуры клеточной стенки [1—4].
У дрожжей и других представителей эукариоти-ческих организмов полиР обнаружены во всех основных компартментах клетки: в цитозоле, ядре, митохондриях, вакуолях, клеточной стенке, и их метаболизм тесно связан с основными процессами, протекающими в данных структурах [1, 3, 4].
Если пути деградации полиР и ферменты, участвующие в этих процессах, у Saccharomyces cerevisiae достаточно хорошо изучены [3—5], то многие вопросы, связанные с синтезом полиР, остаются открытыми. У S. cerevisiae, в отличие от Candida humicola [6], не обнаружена полифосфаткиназа (КФ 2.7.4.1), осуществляющая у бактерий синтез полиР за счет тер-
1 Автор для корреспонденции (e-mail: luvat@rambler.ru).
минального фосфата АТР [2]. Недавно показано, что цитоплазматический домен, по крайней мере, одного из транспортных вакуолярных шаперонов (Vtc4p) содержит сегмент размером в 35 кДа, обладающий полиР полимеразной активностью. Синтез полиР осуществляется за счет терминального фосфата АТР с образованием ADP. При этом данный фермент, в противоположность полифосфаткиназе, не катализирует обратную реакцию синтеза АТР из полиР [7]. Образуются ли таким образом вакуолярные полиР, пока не ясно.
Синтез полиР, локализованных в клеточной стенке дрожжей, протекает при участии долихилдифос-фат-полиР-фосфотрансферазы (КФ 2.7.4.20) [8].
Учитывая, что полиР клеточной стенки и вакуолей в сумме не превышают 30—35% от общего содержания этих соединений в клетке, ясно, что способы образования основного пула полиР у S. cerevisiae остаются открытыми.
Содержание полиР зависит от стадии роста дрожжей, источников углеродного питания и степени аэрации среды [9, 10]. Показано, что ингибирова-ние процесса гликолиза иодацетамидом и окислительного фосфорилирования на уровне дыхатель-
ной цепи антимицином А приводит к снижению синтеза полиР [11, 12].
Получены свидетельства о существовании определенной связи между накоплением полиР и градиентом электрохимического потенциала ионов Н+ [11, 13]. Действие протонофорного разобщителя т-хлоркарбонилцианидфенилгидразона (ХКЦФ) на целые клетки Б. оегеушае, выросшие в среде с глюкозой или лактатом в анаэробных или аэробных условиях, приводило к снижению уровня вакуоляр-ных поли!, детектируемых при помощи Р31-ЯМР-спектроскопии [13].
В вакуолях Б. оегеушае присутствуют низкомолекулярные полиР с длиной цепи п = 18—20 остатков ортофосфорной кислоты [14]. В клетках дрожжей цепь полиР может состоять из 200—250 остатков ортофосфорной кислоты [15].
Из биомассы дрожжей выделяют 5 фракций полиР с возрастающей длиной цепи полимера. Показано, что синтез полиР отдельных фракций преимущественно связан с разными энергопреобразующи-ми процессами. В частности, установлено, что синтез наиболее полимерной V фракции полиР активно протекает у культуры, растущей на этаноле при высокой аэрации среды. В условиях, благоприятных для гликолиза, преимущественно накапливаются полиР1 фракции [9]. Наиболее корректно о синтезе полиР можно судить при кратковременной (не более 30—40 мин) гиперкомпенсации (сверхсинтеза) этих соединений после пересева клеток дрожжей с безфосфатной в обогащенную Р; среду. При более длительной экспозиции или скорость образования полиР падает, или начинают преобладать процессы их потребления, что приводит к снижению содержания полимеров в клетке [9].
Целью данной работы являлось изучение влияния протонофорного разобщителя ХКЦФ на синтез отдельных фракций полиР при росте Б. оегеушае ВКМ У-1173 в средах с разными источниками углерода и разным содержанием О2 в среде.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектом исследования служили дрожжи Бао-окаготуоез оегеу1$1ае ВКМ У-1173. Клетки выращивали на качалке при 29°С в колбах со средой Ридер [15] с 2% глюкозы в качестве источника углерода при низкой, <0.1 ммоль О2/л мин (гипоксия), или высокой, 0.56 ммоль О^л мин, степени аэрации, и при интенсивной аэрации с 1 об. % этанола [10].
Синтез полиР изучали в условиях их гиперкомпенсации. Для этой цели дрожжи выращивали на полноценной среде Ридер до середины логарифмической фазы роста на разных источниках углерода и аэрации среды. Затем клетки стерильно переносили в такие же среды, но лишенные Р;, и растили в течение 7 ч (голодание, -Р). Полученные таким образом клетки вновь переносили в полноценную среду (+Р)
и продолжали растить в течение 0.5 ч в отсутствие ХКЦФ (контроль) или в присутствии разных концентраций ХКЦФ. Выбор 0.5 ч экспозиции обусловлен тем, что именно в этот период роста наблюдается максимальный синтез всех фракций полиР. В последующий период роста накопление суммы полиР резко снижается, а некоторых фракций — вообще приостанавливается [9]. Кроме того, показано, что 0.5 ч инкубации с ХКЦФ достаточно для его максимального поглощения клетками S. cerevisiae [16].
Из полученных клеток выделяли фракции полиР по методу Лангена и Лиса путем последовательной экстракции их из клеток при 0°С растворами кислоты, соли и щелочи. В результате получали следующие фракции полиР: кислоторастворимую (по-лиР1), солерастворимую (полиРП), две щелочерас-творимые — при рН 9—10 (полиРШ) и при рН 12 (полиРГУ). О содержании кислото- щелоченерас-творимой фракции полиРУ судили по ортофосфату, образующемуся после обработки остатка биомассы 0.5 М НСЮ4 при 90°С, дважды по 20 мин [17].
Экстракцию и определение АТР осуществляли с помощью препарата люциферин-люциферазы ("Sigma", США) на приборе люминометр-1250 ("LKB", Швеция), как описано ранее [18].
Скорость потребления О2 интактными клетками измеряли в термостатируемой (29°С) полярографической ячейке (У = 2 мл) с помощью закрытого те-флоновой пленкой платинового электрода типа Кларка, как описано [19]. Определение фосфорных соединений, Р^ глюкозы, оптической плотности (ОП) и веса сухой биомассы дрожжей проводили по известным методам [17].
Представленные экспериментальные результаты получены на основании трех биологических опытов, обработанных статистически [20].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Показано, что в клетках S. cerevisiae низкие концентрации (5—7 мкМ) ХКЦФ приводят к снижению градиента ионов Н+ через вакуолярную мембрану Более высокие концентрации этого агента вызывают деэнергизацию внутренней митохондриальной (10— 15 мкМ) и плазматической (>20 мкМ) мембран [13].
На основании ранее полученных данных о том, что синтез отдельных фракций полиР коррелирует с основными энергопреобразующими процессами в клетках [12], влияние ХКЦФ на синтез полиР изучали на фоне кратковременной (0.5 ч) гиперкомпенсации этих соединений при росте S. cerevisiae ВКМ Y-1173 на глюкозе в условиях недостатка О2 (гипоксия) или при активной аэрации, а также при использовании этанола в качестве источника углерода при активной аэрации [10].
В таблице представлены данные по ингибирую-щему действию ХКЦФ на рост дрожжей. Видно, что при выращивании культуры на глюкозе в гипокси-
Влияние ХКЦФ на рост (ОП530) дрожжей Б. оегеу1з1ае ВКМ У-1173 при культивировании на разных источниках углерода в условиях гиперкомпенсации
Условия эксперимента 2% глюкозы, гипоксия 2% глюкозы, аэрация 1 об. % этанола, аэрация
Исходная культура, —Р^ 7 ч 2.09 2.06 1.53
Гипе Контроль 0.5 мкМ ХКЦФ 1.5 мкМ ХКЦФ 5мкМ ХКЦФ 10 мкМ ХКЦФ 25 мкМ ХКЦФ ;ркомпенсаи 2.28 2.28 2.28 2.27 2.21 2.09 ия, +РЬ 0.5 2.36 2.36 2.36 2.34 2.32 2.07 ч 1.71 1.70 1.58 1.53
ческих и аэробных условиях, по сравнению с контролем (гиперкомпенсация, 0.5 ч), ХКЦФ тормозил рост при 10 мкМ концентрации, а полная остановка роста происходила при 25 мкМ ХКЦФ в среде.
Клетки, растущие на этаноле, оказались более чувствительными к действию протонофора: торможение роста наблюдалось уже при 1.5, а полная остановка — при 5 мкМ ХКЦФ.
Предполагается, что более устойчивый рост дрожжей к действию ХКЦФ на глюкозе объясняется процессом его одновременн
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.