БИОФИЗИКА, 2014, том 59, вып. 6, с. 1108-1112
== БИОФИЗИКА КЛЕТКИ= =
УДК 577.3
ВЛИЯНИЕ МАГНИЯ, АЦЕТИЛСАЛИЦИЛОВОЙ КИСЛОТЫ И ЭМОКСИПИНА НА АГР ЕГАЦИЮ ТР ОМБОЦИТОВ
© 2014 г. С.Ж. Лозникова, А.А. Суходола*, Н.Ю. Шчарбина**, Д.Г. Шчарбин
Институт биофизики и клеточной инженерии НАН Беларуси, 220072, Минск, ул. Академическая, 27, Беларусь; *Институт физики им. Б.И. Степанова НАН Беларуси, 220072, Минск, пр. Независимости, 68, Беларусь; **Республиканский научно-практический центр неврологии и нейрохирургии, 220114, Минск, ул. Скорины, 24, Беларусь E-mail: d.$НсНагЫп@тай.гы Поступила в p едакцию 20.02.13 г. После доработки 25.11.13 г.
Представлены результаты исследования тромбин-индуцированной агрегации тромбоцитов в отсутствие и в присутствии сульфата магния, ацетилсалициловой кислоты и эмоксипина. Показано, что сульфат магния, ацетилсалициловая кислота и эмоксипин при их индивидуальном применении способны снижать степень агрегации тромбоцитов, в то время как их совместное действие не приводит к такому эффекту. Полученные данные могут быть использованы для стратегии выбора лекарственных средств при лечении ишемического инсульта.
Ключевые слова: инсульт, тромбоциты, агрегация, магний, ацетилсалициловая кислота, эмоксипин.
Ишемический инсульт является наиболее распространенным типом инсульта (более 80% от всех случаев инсультов) и входит в тройку лидирующих причин смертности нар яду с сердечно-сосудистыми и онкологическими заболеваниями [1,2]. Первичное лечение инсульта в районе «тер апевтического окна» (до 12 ч после начала инсульта) включает в себя применение тканевого активатора плазминогена и ацетилсалициловой кислоты [3]. Последующее лечение (нейропротекция) направлено на уменьшение выраженности отдаленных последствий ишемии: блокаду провоспалительных цитокинов, молекул клеточной адгезии, торможение сво-боднорадикальных процессов, прерывание апоптоза [4]. С этой целью в клинической практике применяются ацетилсалициловая кислота (АСК) [5], антиоксиданты (эмоксипин) [6] и ионы магния [7]. Важную роль в формировании тромбов играют тромбоциты [2]. Действие образованного в результате каскада коагуляции в зоне повреждения сосуда тромбина приводит к активации и агрегации тромбоцитов. При ишемическом инсульте обнаруживаются тромбы в церебральных артериях, при геморрагическом инсульте - пр изнаки внутр исо судистого свертывания крови (претромбы, фибриновые тромбы, агрегация тромбоцитов, эритроцитов)
Сокращения: АСК - ацетилсалициловая кислота, NMDA -N-метил-Б-асиартат.
[8-10]. Ранее нами было установлено, что применение ионов магния в лечебной концентрации совместно с базисной терапией (важно отметить, что обязательным компонентом при базисной терапии является АСК [6]) приводило к нормализации протекания процессов перекис-ного окисления липидов, улучшало состояние антиоксидантной защиты и снижало дисфункцию гемато-энцефалического барьера у больных с инсультом [11,12]. Однако при комплексном применении базисной терапии, сульфата магния и эмоксипина, какого-либо изменения вышеуказанных параметров по сравнению с применением только базисной терапии не про -исходило [11,12]).
С целью выяснения механизмов клинического действия вышеуказанных препаратов нами были изучены особенности тромбин-инду-цированной агрегации тромбоцитов в присутствии ионов магния, асцетисалициловой кислоты и эмоксипина в лечебных концентрациях, используемых при лечении ишемического инсульта [6].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
а-Т ромбин человека, ацетилсалициловая кислота, соли для приготовления буферных растворов были получены от 81§ша-Л1ёпсЬ (США). М§Б04 и эмоксипин получены от концерна «Белбиофарм» (Беларусь). Объектом исследо-
ВЛИЯНИЕ МАГНИЯ, АЦЕТИЛС АЛИЦИЛОВОЙ КИС ЛОТЫ И ЭМОК C ИПИНА 1109
Pис. 1. Кpивые тромбин-индуцированной агрегации тромбоцитов в отсутствие (1) и в присутствии (2) АС К в концентр ации 0,01 мг/мл.
вания являлись тромбоциты человека. Кровь доноров в консерванте «Глюгицир» получали из Pеспубликанского научно -пр актического центра гематологии и трансфузиологии (Минск) в день эксперимента. Для получения отмытых тр омбоцитов пластиковые пр обир ки с обогащенной тр омбоцитами плазмой центр и-фугир овали пр и 250 g в течение 2 мин для о саждения клеток [13]. К о садку тр омбоцитов в каждую пр обир ку добавляли 300 мкл буфер а Иреланда (0,12 М NaCl, 0,0154 М KCl, 0,006 М глюкозы, 0,0015 М Ш2ЭДТА, 0,0133 М тр ис, рН 6,5), о стор ожно р есуспендир овали тр омбоциты пр и помощи пипетки до обр азования равномерной взвеси клеток. Полученную суспензию клеток вновь центр ифугир овали пр и 250 g в течение 2 мин. Надосадочную жидко сть уда -ляли, а к о садку добавляли буфер И р еланда до обр азования р авномер ной суспензии тр омбоцитов в концентр ации 2,5-109 кл/мл. Агр ега -цию тр омбоцитов исследовали с помощью ав-томатизир ованного агр егометр а АP 2110 пр о -изводства «SOLAR» (Беларусь). Перед регистрацией агрегатограммы в термостатируемую пр и 37°С пластиковую кювету агр егометр а вносили 400 мкл фо сфатно-солевого буфер а Дюль-бекко (0,137 М NaCl, 0,0027 М KCl, 0,0087 М Na2HPO4, 0,00148 М KH2PO4, 0,001 М CaCl2, рН 7,35) и 50 мкл суспензии тр омбоцитов в конечной концентр ации 2,5-108 кл/мл и инку-бир овали в течение 30 мин пр и темпер атур е 37°C. Затем в суспензию добавляли исследуемые препараты и инкубировали в течение 30 мин. После этого в кювету вносили 50 мкл тр омбина в конечной концентр ации 0,32 мкг/мл (1 NIH unit), растворенного в буфере Дюльбекко, и
Рис. 2. Цепень агр егации (P) тр омбоцитов при р азличных концентр ациях сульфата магния в ср еде. 0 - контроль (n = 11), 1 - 2,5 мМ (n = 7), 2 -5 мМ (n = 9), 3 - 10 мМ (n = 7), 4 - 120 мМ MgSO4 (n = 5). *p < 0,05 по отношению к контролю по тесту Данна.
измеряли агр егацию тр омбоцитов. Степень тр омбин-индуцир ованной агр егации тр омбоцитов оценивали по возр астанию светопр опускания суспензии. Полученные результаты были обработаны с использованием программ для статистической обр аботки данных Statistka 6.0 (StatSoft 1пс., США) и BioStat (© S.A. Glantz). Числовые данные пр овер ены на но р мальность распределения с помощью критерия Шапиро-Уилка (Shapiro-Wilk) ([14], сс. 77-79) и теста р авенства дисперсий. P езультаты пр едставлены в виде медианы и интервала между 25 и 75 процентилями ([14], сс. 83-85, [15], сс. 31-33). Для анализа показателей использовали непар а -метр ические кр итер ии ср авнения - тесты Ф р ид-мана (Friedman) или К р а скелла-Уоллиса (Krus-kal-Wallis) дисперсионного анализа (one-way AN OVA) ([14], сс. 51-53). В случае выявления р азницы по кр итер ию К р аскелла-Уоллиса пр и необходимости проводился «post-hoc» анализ на основе теста множественных сравнений Дан-на (Dunn) ([15], сс. 359-364).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
На р ис. 1 пр едставлены пр имер ы кр ивых тр омбин-индуцир ованной агр егации в отсутст-вие и в пр исутствии А С К. На рис. 2 пр едставлены результаты по изучению влияния ионов магния на степень тр омбин-индуцир ованной аг-р егации тр омбоцитов. Как видно из р исунка, ионы магния в концентр ациях 2,5 мМ (п = 7) и 5 мМ (п = 9) не вызывали статистически достоверного снижения степени агр егации тр омбоцитов по отношению к контр олю (п =
1110
ЛОЗНИКОВА и др.
Рис. 3. Степень агрегации (Р) тромбоцитов в отсутствие (светлый столбец) и в присутствии (темный столбец) АСК (а) и эмоксипина (б) в лечебных концентрациях. [АСК] = 0,01 мг/мл (п
8); [эмоксипин] = 0,001 мМ (п
=7). *р <
0,05 по отношению к контролю по тесту Фридмана.
Рис. 4. Степень агрегации (Р) тромбоцитов в отсутствие (светлый столбец) и в присутствии (темный столбец) смеси сульфата магния, АСК и эмоксипина в лечебных концентрациях. [М^О^] = 5 мМ; [АСК] = 0,01 мг/мл; [эмоксипин] = 0,001 мМ; п = 13 как для контроля, так и воздействия. Достоверного различия по отношению к контролю нет (р = 0,56 по тесту Краскела-Уоллиса).
11). Следует отметить, что концентрации сульфата магния < 5 мМ являются концентрациями, эквивалентными лечебным: такие концентрации ионов магния наблюдаются в крови у больных при лечении их препаратами магния [6,16,17]. В наших условиях только концентрация ионов магния 10 мМ (п = 7) вызывала достоверное снижение степени агрегации тромбоцитов по отношению к контролю (р < 0,05 по тесту Данна). Увеличение концентрации ионов магния в среде до 120 мМ (п = 5) приводило к практически полному ингибированию тромбин-индуцированной агрегации тромбоцитов (р < 0,05 по отношению к контролю по тесту Данна). На рис. 3а представлено влияние на агр егацию тромбоцитов АСК в концентрации 0,01 мг/мл (п = 8). Данная концентрация является эквивалентной лечебной концентрации А СК в крови у пациентов при ее использовании [18,19]. Так, у пациентов с инсультом, получавших ежедневно 1,5 г АС К, ее концентрация в крови составляла 0,01 мг/мл [21]. Из рисунка видно, что АСК в исследуемой концентрации достоверно снижала степень агрегации тромбоцитов (р < 0,05 по тесту Ф р идмана). Согласно результатам, представленным на рис. 3б, эмоксипин в исследуемой (эквивалентной лечебной) концентрации 0,001 мМ (п = 7) [6,20,21] также был способен достоверно снижать агрегацию тромбоцитов (р < 0,05 по тесту Фридмана). Однако совместное пр именение сульфата магния в концентрации 5 мМ, А СК - 0,01 мг/мл и эмоксипина - 0,001 мМ (рис. 4) пр иводило к неожи-
данному эффекту - наблюдалось отсутствие какого-либо влияния их комплекса (смеси) на тромбин-индуцированную агр егацию тромбоцитов (р = 0,56 по тесту К рускала-Уоллиса, п = 13 как для контроля, так и в случае воздействия).
Для объяснения данного эффекта следует учесть следующие обстоятельства. Использованные нами в работе препараты и их комплексы (смеси) широко применяются в клинической практике для лечения инсульта [6]. Каждый из препаратов имеет свою область воздействия на организм. Одним из основных патогенетических звеньев при ишемии головного мозга является длительная активация К-метил-Б-аспартат (КМВЛ)-рецепто ров глутаматом, приводящая к открытию кальциевых каналов и поступлению внутрь клетки избыточного количества ионов кальция, что приводит в итоге к ее
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.