БИОЛОГИЯ ВНУТРЕННИХ ВОД, 2014, № 1, с. 87-92
ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ ФИЗИОЛОГИЯ И БИОХИМИЯ ГИДРОБИОНТОВ
УДК 597-113:581.526.3
ВЛИЯНИЕ МАКРОФИТОВ НА АКТИВНОСТЬ ПИЩЕВАРИТЕЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ КИШЕЧНИКА РЫБ: ИССЛЕДОВАНИЕ in vitro
© 2014 г. В. В. Кузьмина
Институт биологии внутренних вод им. И.Д. Папанина РАН, 152742 пос. Борок, Ярославская обл., Некоузский р-н, e-mail: vkuzmina@ibiw.yaroslavl.ru Поступила в редакцию 27.11.2012 г.
Показано, что наличие в инкубационной среде измельченных листьев макрофитов, входящих в состав водной и прибрежно-водной растительности, как правило, стимулирует активность гликозидаз, но слабо влияет на активность протеиназ слизистой оболочки кишечника рыб. В присутствии экстрактов листьев тех же видов макрофитов активность ферментов обеих цепей снижается. Обсуждены механизмы влияния листьев макрофитов и их экстрактов на активность пищеварительных гидролаз и, как следствие, на эффективность начальных этапов ассимиляции углеводных и белковых компонентов пищи рыб.
Ключевые слова: макрофиты, рыбы, протеиназы, гликозидазы, слизистая оболочка. DOI: 10.7868/S0320965214010094
ВВЕДЕНИЕ
Естественная пища рыб многокомпонентна, причем абсолютное число видов — зоофаги [2, 19]. Несмотря на это, в состав пищи многих видов рыб входят различные низшие и высшие растения. Макрофитами питаются не только узкоспециализированные макрофитофаги, но и рыбы, относящиеся по типу питания к другим экологическим группам. Так, макрофиты встречаются в пище у бентофагов густеры, леща и плотвы, в меньшей степени — у бентофага — факультативного ихтиофага ерша и ихтиофага — факультативного бентофага окуня, обитающих в большинстве водоемов России, в том числе фактически во всех водохранилищах Волжского каскада [2]. Поскольку один из основных компонентов тканей макрофитов — целлюлоза, важно отметить, что она, будучи поставщиком пластических и энергетических веществ, обладает адсорбционными свойствами.
А.М. Уголев [12], анализируя закономерности мембранного пищеварения, подчеркивал наличие существенных различий в свойствах одних и тех же ферментов в зависимости от того, функционируют они в полости или на поверхности энтероцитов. Первые растворены в водной фазе. Структурная организация ферментных систем ограничена, причем возможна любая ориентация их активных центров по отношению к субстратам. Вторые — структурированы, активные центры ферментов ориентированы по отношению к субстратам. Попадая в пищеварительный тракт животных, макрофиты могут играть двоякую роль. При этом целлюлоза может адсорбировать как различные компоненты пищевой смеси, так и пищеварительные ферменты. Кро-
ме того, в состав тканей растений входят различные вещества, способные модифицировать активность ферментов. Пищеварительные ферменты, обеспечивающие деградацию биополимеров, — регулируемые. Ранее подробно исследованы закономерности полисубстратных процессов, протекающих в пищеварительном тракте млекопитающих [12] и рыб [14]. В условиях, когда реакционная смесь помимо субстрата анализируемой реакции содержит один или более субстратов других реакций, последние оказывают значительное влияние на активность и свойства ферментов рыб [4, 5, 10, 14]. Пониманию механизма влияния веществ-модификаторов на ферментативную активность способствовали представления об аллостерической регуляции ферментов, которая возможна благодаря связыванию вещества-регулятора с ферментом в регуляторном центре, пространственно не совпадающем с обеспечивающим катализ активным центром фермента. В результате этого может изменяться конформация активного центра фермента и, следовательно, его каталитические свойства [20, 22]. При исследовании действия модификаторов на ферменты, обеспечивающие процессы пищеварения, как правило, анализировали влияние модельных мономеров, реже — димеров, преимущественно входящих в состав белков, а также липидов и углеводов, характерных для пищи животного происхождения [10, 12, 14].
Вместе с тем макрофиты синтезируют целый ряд экзометаболитов, некоторые из них обладают токсическими свойствами и способны влиять на жизнедеятельность других организмов [15]. Кроме того, растения могут накапливать токсические вещества, в частности тяжелые металлы [8], которые могут су-
щественно влиять на активность пищеварительных ферментов рыб. Однако сведения о влиянии макро-фитов на активность пищеварительных ферментов рыб до последнего времени отсутствовали.
Цель работы — изучение влияния разных видов макрофитов на активность гликозидаз и протеи-наз, функционирующих в кишечнике рыб с различным типом питания.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объекты исследования. Рыбы: бентофаги стерлядь Acipenser ruthenus L. (426 ± 45 г), лещ Abramis brama (L.) (628 ± 24 г), плотва Rutilus rutilus (L.) (284 ± 30 г) и карп Cyprinus carpio L., ихтиофаг — факультативный бентофаг окунь Perca fluviatilis L. (148 ± 14 г), а также ихтиофаги щука Esox lucius L. (582 ± 28 г) и налим Lota lota (L.) (520 ± 46 г); макрофиты: рдест блестящий Роtamogeton lucens L., рдест пронзеннолистный Роtamogeton perfoliatus L., горец земноводный Роlygonum amphybium L., водокрас обыкновенный Hydrocharis morsus-ranae L., ряска трехдольная Lemna trisulca L., элодея канадская Elodea canadensis L., капуста водяная Ceratopteris pteridoides L. и валлиснерия спиральная Vallisneria spiralis L.
Материал собран в Волжском плесе Рыбинского водохранилища. Рыб после поимки и доставки в лабораторию в течение нескольких суток до опыта содержали в принудительно аэрируемых бассейнах, летом при температуре воды 18—20°C, зимой — 12—14°C. Для получения ферментативно активных препаратов у рыб вскрывали брюшную полость, изымали и помещали на ледяную баню висцеральные органы. Кишечники очищали от жира, разрезали вдоль, промывали раствором Рингера для холоднокровных животных (103 мМ NaCl, 1.9 мМ KCl, 0.45 мМ CaCl2, 1.4 мМ MgSO4, рН 7.4) и специальным скребком снимали слизистую оболочку среднего отдела кишечника. Для того чтобы исключить индивидуальную вариабельность активности ферментов, слизистую от 5—8 экз. рыб объединяли и тщательно перемешивали. Затем отбирали требуемое количество материала для приготовления исходного гомогената. Навески тканей гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе с раствором Рингера (разведение 1 : 39 при определении активности гликозидаз и 1 : 99 — протеиназ) при температуре 0—4°С.
Для оценки влияния макрофитов на активность ферментов, обеспечивающих гидролиз белковых и углеводных компонентов пищи, в пробирки с субстратом и гомогенатом добавляли 50 мг сухих или сырых измельченных листьев растений в растворе Рингера (0.45 мл) или 0.5 мл их экстракта. Для приготовления экстракта 250—500 мг размельченных сухих или сырых листьев растений помещали в пробирки, заливали их 5 мл раствора Рингера, тщательно перемешивали и оставляли на 0.5 ч при комнатной температуре. Затем пробы центрифугировали в течение 15 мин при 3000 об ./мин. В качестве контроля ис-
пользовали реакционную смесь, в которую вместо измельченных листьев макрофитов или их экстрактов добавляли 0.5 мл раствора Рингера. Принципиальные различия в действии свежих и высушенных растений не выявлены. В ряде опытов для устранения возможных адсорбентов неизвестной природы сырые листья до измельчения промывали водой.
Общую амилолитическую активность (АА, суммарная активность а-амилазы, КФ 3.2.1.1, глюкоамилазы, КФ 3.2.1.3 и ферментов группы мальтаз, КФ 3.2.1.20) определяли методом Нельсона в модификации А.М. Уголева и Н.Н. Иезуи-товой [13]. Общую протеолитическую активность (ПА, преимущественно активность трипсина, КФ 3.4.21.4) оценивали по увеличению концентрации тирозина по методу Ансона [17] в некоторой модификации. Для определения АА в качестве субстрата использовали 1%-ный раствор растворимого крахмала (рН 7.4), протеолитической активности — 1%-ный раствор казеина (рН 7.4). Гомогенат, субстрат и макрофиты инкубировали при температуре 20°С в течение 30 мин при непрерывном перемешивании в четырех—восьми повторностях. Об уровне ферментативной активности судили по приросту продуктов реакции за 1 мин инкубации субстрата и ферментативно активного препарата с учетом фона (количество глюкозы или тирозина в исходном гомогенате) в расчете на 1 г сырой массы ткани и выражали в мкмоль/(г • мин). Результаты обработаны статистически c помощью стандартного пакета программ (Microsoft Office'95, приложение Excel). Достоверность различий между средними арифметическими рассчитывали с помощью критерия Стьюдента для малых выборок прир < 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Влияние макрофитов на АА слизистой оболочки кишечника рыб. Добавление в инкубационную смесь измельченных листьев растений увеличивает АА слизистой оболочки, наиболее значительно при использовании горца земноводного (табл. 1). При добавлении в инкубационную смесь экстракта листьев растений всегда наблюдается ингибирующий эффект, наиболее ярко выраженный у водяной капусты. Необходимо отметить, что в табл. 1 приведены данные только тех опытов, в которых одновременно исследовали влияние на АА измельченных листьев и экстрактов растений.
При исследовании влияния макрофитов на АА слизистой оболочки кишечника леща получены близкие результаты (табл. 1). При добавлении в инкубационную смесь измельченных листьев растений АА слизистой оболочки также во всех случаях увеличивалась. При этом эффект рдеста блестящего был в 3 раза более значительным по сравнению с таковым у плотвы. При добавлении в инкубационную смесь экстракта листьев наблюдался разный по величине ингибирующий эффект.
ВЛИЯНИЕ МАКРОФИТОВ НА АКТИВНОСТЬ ПИЩЕВАРИТЕЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ 89
Таблица 1. Влияние макрофитов на АА слизистой оболочки кишечника рыб
Макрофиты Контроль Опыт
мкмоль/(г • мин) мкмоль/(г • мин) % контроля
Плотва
Валлиснерия 5.95 ± 0.15 7 .51 ± 0.25 5 .38 ± 0.18 1 2.6 -9. 6
Рдест блестящий 15.58 ± 0.70 1 7.1 3 ± 0. 86 1 4.1 3 ± 0. 22 9.9 -9. 3
Горец земноводный 8.59 ± 0.13 1 0. 73 ± 0.03 8.26 ± 0.11 2 4.9 -3. 8
Капуста водяная 12.63 ± 0.28 14.4 5 ± 0 .1 2 7 .9 6 ± 0 .6 6 Лещ 14. 4 -37 . 0
Водокрас обыкновенный 3.91 ± 0.12 5
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.