БИОФИЗИКА, 2014, том 59, вып. 5, с. 848-853
МОЛЕКУЛЯР НАЯ БИОФИЗИКА =
УДК 577.03
ВЛИЯНИЕ МАЛЫХ ДОЗ ЭКЗОГЕННОГО НИТР ИТА НА ОКИСЛИТЕЛЬНЫЕ МОДИФИКАЦИИ ВОДОРАСТВОРИМЫХ БЕЛКОВ СЕРДЕЧНОЙ И СКЕЛЕТНОЙ МЫШЦ КРЫС
© 2014 г. Н.В. Кулева, И.Е. Краеовекая, Т.Е. Шумилова
Биологический факультет Санкт-Петербургского государственного университета, 199034, Санкт-Петербург, Центральная наб., 7-9 E-mail: nadezhda.kuleva@gmail.сот Поступила в p едакцию 19.06.14 г.
И сследовано влияние введения малых доз экзогенного нитрита на обратимые и необратимые окислительные модификации водорастворимых белков сердечной и скелетной мышц крыс методами редокс-двухмерного электрофореза и фотометрического определения количества карбонильных групп соответственно. Для объяснения отсутствия изменений в окислении белков в условиях нитритной гипоксии привлечена гипотеза о защитном действии блокирования образующимся из нитрита оксидом азота определенных участков электрон-транспортной цепи митохондрий.
Ключевые слова: нитриты, оксид азота, острая нитритная гипоксия, окисление белков.
Неорганические формы азота (нитраты и нитриты) участвуют в геохимическом цикле азота, в котором азот воздуха фиксируется бактериями в форме доступного для живых ор га-низмов иона аммония и окисляется в процессе нитрификации. В научно-популяр ной литературе нитрат- и нитрит-анионы широко известны как нежелательные элементы пищевых цепей с потенциально канцер огенным влиянием. Среди биохимиков и физиологов в недалеком про -шлом эти анионы рассматр ивались как инертные конечные продукты эндогенного метаболизма оксида азота (NO). Однако около 20 лет назад было показано, что нитраты и нитриты могут метаболизироваться in vivo с образованием NO и других биологически активных окислов азота. Таким образом, нитраты и нитр иты представляют собой важный альтернативный источник NO в ор ганизме млекопитающих, осо -бенно во время гипоксии, когда зависящий от кислорода путь образования NO из аргинина посредством NO-синтаз может быть нарушен. Предполагают, что превращение нитрат-нит-рит-NO имеет важные биологические функции и возможно внедрение оксида азота в питание человека для улучшения функционирования сердечно-сосудистой системы [1,2]. Более того, большое число исследований предполагает терапевтический потенциал для нитрата и нит-
Сокращения: NO - оксид азота, ЛД50 - полулетальная доза.
рита в отношении таких болезней, как инфаркт миокарда, инсульт, гипертония, почечная недостаточность и язва желудка [3]. Однако такого рода терапия несет в себе реальную опасность усиления оксидативного и развития нит-розивного стресса у пациентов, адаптационные ресурсы которых могут быть в значительной степени истощены.
Согласно недавно полученным данным [4], введенный с пищей нитрит может ослаблять окислительный стресс и активировать антиок-сидантные гены в сердце кр ысы при гипер барической гипоксии. Поскольку при введении нитрита в дозе 3 мг на 100 г массы животного также имеет место гипоксия (гемическая), в работе была предпринята попытка установить, развивается ли в этих условиях окислительный стресс. Показателями стресса могут быть окислительные модификации белков, обратимые и необратимые. Обратимые окислительные модификации белков (нитрование тирозина, окисление БИ-групп) также могут быть элементами редокс-сигналинга в условиях оксидативного и нитрозивного стресса [5].
Задачей настоящей работы является изучение обратимых и необратимых окислительных модификаций водор астворимых белков скелетных и сердечной мышц кр ыс при введении им подкожно нитр ита натрия в малых дозах: 1 и 3 мг/100 г массы животного. Такая дозировка нитрита выбрана в связи с тем, что уже исследовано влияние именно этих доз нитрита на
функционирование сердечно-сосудистой системы крыс [6] и показано, что имеет место благоприятный эффект при ишемии-реперфузии сердца и других органов крыс [7].
В качестве необратимых модификаций в настоящей работе изучено образование карбонильных производных белков, в качестве обратимой модификации рассматривается окисление сульфгидрильных групп с образованием в белках дисульфидных связей.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектом исследования служили крысы линии массой 150-230 г. Опыты пр оводили под общим нембуталовым наркозом (4-5 мг/100 г массы тела). Животным подкожно вводили водный раствор нитрита натрия (КаК02) в объеме 0,5 мл из расчета 1 или 3 мг/100 г массы тела. Контрольным животным вместо нитрита вводили физиологический раствор. За состоянием животных наблюдали в течение полутора часов: записывали электрокардиограммы с помощью электрокардиографа «Салют» (Россия) и регистрировали среднее артериальное давление в бедренной артерии открытым методом с использованием датчика давления фирмы «Мо-1;ого11а» [6].
Затем крыс декапитировали, проводили забор крови из аорты и образцов ткани сердца и икроножной мышцы. Часть крови использовали для определения доли метгемоглобина непрямым цианидным методом в модификации Кушаковского [8]. Плазму и форменные элементы крови разделяли центрифугир ованием в течение 5 мин при 5000 g. Плазму использовали для определения концентрации белка [9] и со -держания нитрита фотоколориметрическим методом с помощью реактива Грисса [10].
Образцы тканей из икроножной мышцы и сердца гомогенизир овали в 10-кратном объеме калий-фосфатного буфера (рН 7,4) при помощи ножевого гомогенизатор а (Ро1у11гоп) три раза по 30 с. Полученный гомогенат центрифугиро -вали 15 мин при 15600 g. Супернатант использовали для определения содержания белка [10] и степени его карбонилирования [11], а также проведения диагонального двухмерного электрофореза [12].
Степень карбонилирования белков определяли спектрофотометрическим методом после реакции с 2,4-динитрофенилгидразином [11]. Перед проведением электрофореза из экстракта удаляли нуклеиновые кислоты [11].
П ринцип, лежащий в основе способа идентификации белков, образующих дисульфидные мостики при окислительном стрессе, и методики
«диагонального» или «редокс»-двухмерного электрофор еза со стоит в том, что белки, обра -зовавшие Б-Б-мостики, разделяют по молекулярной массе посредством одномерного электрофореза в невосстанавливаюших условиях (без добавления в пробы 2-меркаптоэтанола) на полиакриламидном геле по Лэммли. Затем полоску геля с разделенными белками вырезают и инкубируют в 3 мл буфера, содержащего 100 мМ дитиотреитола, в течение 15 мин, и, таким обр азом, восстанавливают Б-Б-связи до сульф-гидрильных групп. Когда эту полоску геля прикладывают горизонтально к новому блоку по-лиакриламидного геля, слева от диагонали, образованной белками, присутствующими в полоске, оказываются белки, образовавшие исходно Б-Б-связи. Они могут быть окрашены кра сителем Кумасси в250 и идентифицир ованы с помощью масс-спектрометрии или иммуно-блоттинга [12].
Все полученные данные подвергались статистической обр аботке (Ехсе1-2007, 8Р88-16). В таблицах представлены средние значения из четырех биологических повторностей. В таблицах и в тексте плюс/минус обозначает довер итель-ный интервал (Р = 0,05). Представленные на электрофореграммах результаты являются данными типичного опыта, который воспроизводился три-четыре р аза.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
При исследовании влияния введения малых доз экзогенного нитрита крысам показано, что доза 1 мг на 100 г массы животного не приводит к заметному повышению доли метгемоглобина в суммар ном содержании гемоглобина в крови крыс (5,2 ± 1,9 и 5,5 ± 2,0% - контроль и опыт соответственно, п = 4). При введении 3 мг КаКО2 на 100 г массы содержание метгемогло-бина в крови увеличивалось до 10,4 ± 2,4% (п = 4), что соответствует средней степени ге-мической гипоксии (табл. 1). Это именно то нежелательное последствие применения нитрита, которое вместе с открытой позже возможностью канцерогенного эффекта нитрита на животных уменьшило интер ес к сосудо расшир яю-щему компоненту фармакологического действия нитрита.
Полулетальная доза (ЛД50) нитрита для лабораторных животных составляет 2,6 ммоль на 1 кг массы [1], т.е. 18 мг на 100 г массы, поэтому использованные в работе дозы нитрита не представляют значительной опасности для жизни животных. Тем не менее именно это обстоятельство задержало исследование роли
Таблица 1. Влияние введения нитрита на содержание в плазме крови крыс нитрита, метгемоглобина и на снижение среднего артериального давления в бедренной артерии
Доза нитрита, мг/100 г массы животного Содержание нитрита, нг/мл плазмы крови Амплитуда уменьшения артериального давления, мм рт. ст. Время сохранения пониженного артериального давления, мин Содержание метгемоглобина, % от суммарного гемоглобина
Контроль 12,4 ± 5,1 - - 5,2 ± 1,9
1,0 9,8 ± 4,1 54 ± 6 25-35 5,5 ± 3,0
3,0 50,4 ± 23,3 66 ± 4 35-55 10,4 ± 3,4
нитрита в контролировании нормального артериального давления у человека на 20 лет.
Дозы нитрита, использованные в настоящей работе, оказывают значительное (54-66 мм рт. ст.) понижающее влияние на среднее артериальное давление в бедренной артерии крыс (табл. 1), которое сопровождается развитием брадикардии, уменьшением минутного объема кровотока, ударного объема сердца на фоне снижения общего периферического сопротивления [6]. Что же происходит с нитритом, введенным подопытным животным?
Данные о превращениях нитрита, введенного экспериментальным животным, достаточно разнообразны. Так, было показано, что концентрация нитрита в васкулярных тканях значительно выше, чем в плазме крови крыс [1]. П ри введении нитрита интраперитонеально наблюдали дозо- и нитрозилзависимое S-нитро-зирование и нитрозилирование гемов (образование NO-гемов) во многих тканях: плазме кро -ви, эритроцитах, сердце, печени, почках, легких, кроме тканей мозга и аорты [13]. Окисление до нитрата происходило значительно более медленно. П ри этом в физиологических условиях не было обнаружено образование NO, которое обычно связано с вазодилятацией. Это можно объяснить прямым сигнальным эффектом нитрита, независимым от NO и обусловленным посттрансляционной модификацией белка за счет нитрования. Кроме того, снижение давления может осуществляться неп
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.