ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2015, том 462, № 4, с. 497-499
КЛЕТОЧНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 612.085.2+577.175.8+57.085.23
ВЛИЯНИЕ МАРИНОБУФАГЕНИНА НА РОСТ И ПРОЛИФЕРАЦИЮ КЛЕТОК В ОРГАНОТИПИЧЕСКОЙ КУЛЬТУРЕ ТКАНИ
© 2015 г. В. А. Пеннияйнен, А. В. Кипенко, Е. В. Лопатина, А. Я. Багров, Б. В. Крылов
Представлено академиком РАН Н.П. Весёлкиным 27.06.2014 г. Поступило 14.07.2014 г.
DOI: 10.7868/S0869565215160306
№+,К+-АТФаза — встроенный в плазматическую мембрану фермент, который выполняет не только функцию активного транспорта ионов Na+ и К+, но и служит трансдуктором внутриклеточных сигналов в клетках разных тканей [12, 13]. В сенсорных нейронах млекопитающих Na+,K+-АТФаза в качестве трансдуктора участвует в передаче сигналов от опиоидоподобных рецепторов к медленным натриевым каналам Na^.8 [2, 11]. Обнаружено, что эта мембранная структура участвует во внутриклеточных сигнальных каскадах, регулирующих рост и пролиферацию клеток разных типов [3— 5, 8, 10—13]. Эта новая "сигнальная" функция №+,К+-АТФазы, по-видимому, модулируется эндогенными дигиталисподобными факторами (уа-баином, маринобуфагенином) через активацию целого ряда сигнальных путей, в том числе Src-опосредуемых [6, 8, 12, 13]. Известно, что уабаин и маринобуфагенин в культуре клеток почечных канальцев запускают сигнальные пути, инициирующие соответственно клеточный рост и апо-птоз [7].
Маринобуфагенин, ингибитор №+,К+-АТФа-зы, относится к группе кардиотонических стероидов буфадиенолидной природы. Первоначально маринобуфагенин был обнаружен в коже жаб Bufo marinus, где он реализует свою физиологическую роль, регулируя экскрецию натрия. В 90-х годах прошлого века соединения группы буфадиеноли-дов были обнаружены в организме млекопитающих [6, 8, 9]. Концентрации эндогенных дигита-
Институт физиологии им. И.П. Павлова Российской Академии наук, Санкт-Петербург E-mail: krylovbv@yandex.ru, krylov@infran.ru Федеральный медицинский исследовательский центр им. В.А. Алмазова, Санкт-Петербург Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова
Российской Академии наук, Санкт-Петербург
лисподобных факторов в системном кровотоке в норме очень малы. Содержание уабаина находится в пределах 300—1000 пМ, маринобуфагенина — около 400 пМ [10]. Повышение уровня эндогенного маринобуфагенина отмечается при некоторых патологических состояниях, таких как эссенциальная гипертензия, инфаркт миокарда, диабет, хроническая почечная недостаточность. Было установлено, что маринобуфагенин участвует в развитии системной вазоконстрикции и патогенезе гестоза [6, 8].
Целью настоящего исследования было сравнительное изучение влияния дигиталисподобно-го фактора маринобуфагенина на рост и пролиферацию клеток разных тканей в органотипиче-ской культуре.
Объектами исследования служили эксплантаты сенсорных ганглиев, ткани сердца, сетчатки глаза, кожи и печени 10-12-дневных куриных эмбрионов. Исследования проводили на 1200 эксплантатах 10—12-дневных куриных эмбрионов, культивируемых в чашках Петри на подложках из коллагена в СО2-инкубаторе ("Sanyo", Япония) в течение 3 сут при 36.5°C и 5% СО2. Питательная среда содержала 45% раствора Хенкса, 40% среды Игла с добавлением инсулина (0.5 ед./мл), 0.6% глюкозы, 2 мМ глютамина, 100 ед./мл гентамици-на, 5% куриного эмбрионального экстракта и 10% эмбриональной телячьей сыворотки [1, 3—5, 11]. Контрольные эксплантаты культивировали в условиях питательной среды. В экспериментальных чашках в культуральную среду добавляли маринобуфагенин. Для визуализации объектов использовали микроскоп Axiostar Plus ("Carl Zeiss", Германия). Полученные изображения анализировали с помощью программы ImageJ. Работа выполнена на оборудовании ЦКП "Конфокальная микроскопия" Института физиологии им. И.П. Павлова РАН. Для количественной оценки роста эксплантатов применяли морфометрический метод. Индекс площади (ИП) рассчитывали как отношение пло-
498
ПЕННИЯЙНЕН и др.
ИП, % 120 г
□ Контроль ПЦ Сенсорные ганглии Н Сердце ^ Кожа 0 Сетчатка ЕЗ Печень
Рис. 1. Изменение индекса площади (М ± т) эксплантатов исследуемых тканей 10-12-дневных куриных эмбрионов через 3 сут. культивирования в среде, содержащей маринобуфагенин; * — р < 0.05 по сравнению с контролем. Число исследуемых образцов в каждой группе указано в тексте.
щади всего эксплантата, включая зону роста, к исходной площади эксплантата. Контрольное значение ИП принимали за 100%. Статистический анализ проводили с помощью программы 8ТАТ18Т1СА 6.0, использовали критерий t Стьюдента.
Маринобуфагенин был исследован в широком диапазоне концентраций (10-10—10-4 М). В больших концентрациях маринобуфагенин (10-4 М и 10-5 М) полностью блокировал рост нейритов сенсорных ганглиев, эксплантатов ткани сердца, сетчатки глаза, печени и кожи (рис. 1). Введение в питательную среду препарата в меньшей концентрации (10-6 М) вызывало достоверное инги-бирование роста нейритов на 44.5 ± 3% (п = 26, р < 0.05), эксплантатов ткани сердца — на 60.2 ± ± 2% (п = 27,р < 0.05), эксплантатов ткани сетчатки — на 53 ± 5% (п = 25, р < 0.05) по сравнению с контрольными значениями (п = 27). ИП эксплантатов ткани печени и кожи при культивировании в питательной среде, содержащей маринобуфагенин в концентрации 10-6 М, был на 50 ± 5% (п = 28, р < 0.05) ниже контрольных значений. При концентрации, равной 10-7 М, маринобуфагенин достоверно ингибировал рост нейритов сенсорных ганглиев, эксплантатов ткани сердца, сетчатки,
печени и кожи. ИП был меньше контрольного значения в среднем на 24 ± 2% (п = 27, р < 0.05, рис. 1). Введение в культуру маринобуфагенина в концентрациях, сопоставимых с эндогенными (10-8 М и ниже), практически не влияло на рост эксплантатов исследуемых тканей (рис. 1).
Таким образом, маринобуфагенин дозозави-симо регулирует рост и пролиферацию клеток исследуемых тканей, причем его эндогенные концентрации (10-10 М) оказываются неэффективными.
Для выявления участия 8гс-киназы в нейрит-ингибирующем действии маринобуфагенина использовали ингибитор 8гс-киназы — РР2. В концентрации 10-5 М РР2 на рост эксплантатов не влиял. Культивирование сенсорных ганглиев в среде, содержащей маринобуфагенин (10-6 М) и ингибитор 8гс-киназы РР2 (10-5 М), не устраняло нейритингибирующий эффект маринобуфагенина. ИП был меньше контрольного значения на 44.5 ± 2% (п = 27, р < 0.05), так же как при действии одного маринобуфагенина (10-6 М). Полученные результаты свидетельствуют о том, что 8ге-киназа в реализации нейритингибирующего действия маринобуфагенина не участвует, а эф-
ВЛИЯНИЕ МАРИНОБУФАГЕНИНА
499
фекты маринобуфагенина на рост нейритов связаны с его действием на насосную функцию Ш+,К+-АТФазы.
Таким образом, полученные экспериментальные данные позволяют предположить, что влияние маринобуфагенина на рост клеток разных типов в эмбриональном периоде развития связано с модуляцией не сигнальной, а насосной функции Ш+,К+-АТФазы.
Работа поддержана грантом РНФ № 14—15— 00677.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Кипенко А.В., Пеннияйнен В.А., Лопатина Е.В., Ро-гачевский И.В., Цырлин В.А., Крылов Б.В. // Рос. физиол. журн. 2009. Т. 95. № 2. С. 137-142.
2. Крылов Б.В., Дербенев А.В., Подзорова С.А., Людыно М.И., Кузьмин А.В., Изварина Н.Л. // Рос. физиол. журн. 1999. Т. 85. № 2. С. 225-236.
3. Лопатина Е.В., Карецкий А.В., Пеннияйнен В.А., Виноградова Т.В. // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 2008. Т. 146. № 12. С. 651-653.
4. Лопатина Е.В., Пеннияйнен В.А., Зайка А.А. // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 2005. Т. 140. № 8. С. 150-153.
5. Пеннияйнен В.А., Кипенко А.В., Лопатина Е.В., Крылов Б.В. // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 2012. Т. 154. № 10. С. 410-412.
6. Федорова О.В., Коростовцева Л.С., Шапиро Дж.И., Багров А.Я. // Артериал. гипертензия. 2008. Т. 14. № 3. С. 220-232.
7. Akimova O.A., Bagrov A.Y., Lopina O.D., Kamer-nitskyA.V., Tremblay J., Hamet P., Orlov N. // J. Biol. Chem. 2005. V. 280. № 1. P. 832-839.
8. Bagrov A.Y., Shapiro J.I., Fedorova O.V. // Pharmacol. Rev. 2009. V. 61. № 1. P. 9-38.
9. Bagrov A.Y., Fedorova O.V., Dmitrieva R.I., Howald W.N., Hunter A.P., Kuznetsova E.A., Shpen V.M. // Hypertension. 1998. V. 31. № 5. P. 1097-1103.
10. Li J. Na,K-ATPase as a Signaling Transducer. Stockholm.: Depart. Woman and Child Health; Paediatric Unit, Astrid Lindgren Children's Hospital Karolinska Inst., 2007. 71 p.
11. Lopatina E.V., Yachnev I.L., Penniyaynen V.A., Plakhova V.B., Podzorova S.A., Shelykh T.N., Ro-gachevsky I.V., Butkevich I.P., Mikhailenko V.A., Kipenko A.V., Krylov B.V. // Med. Chem. 2012. V 8. № 1. P. 33-39.
12. Schoner W., Scheiner-Bobis G. // Semin. Nephrol. 2005. V. 25. № 5. P. 343-351.
13. XieZ., Askari A. Na+/K+-ATPase as Signal Transducer // Europ. J. Biochem. 2002. V. 269. № 10. P. 2434-2439.
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.