научная статья по теме ВЛИЯНИЕ МЕХАНИЧЕСКОГО ИЗМЕЛЬЧЕНИЯ СФАГНУМА НА СТРУКТУРУ И ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ СООБЩЕСТВ Биология

Текст научной статьи на тему «ВЛИЯНИЕ МЕХАНИЧЕСКОГО ИЗМЕЛЬЧЕНИЯ СФАГНУМА НА СТРУКТУРУ И ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ СООБЩЕСТВ»

МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 83, № 6, с. 712-721

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

УДК 631.46

ВЛИЯНИЕ МЕХАНИЧЕСКОГО ИЗМЕЛЬЧЕНИЯ СФАГНУМА НА СТРУКТУРУ И ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ СООБЩЕСТВ

© 2014 г. Т. Г. Добровольская1, А. В. Головченко, А. В. Якушев, Н. А. Манучарова, Е. Н. Юрченко

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, факультет почвоведения

Поступила в редакцию 03.04.2014 г.

Методом микрокосмов экспериментально доказано, что в результате механического измельчения сфагнума происходят увеличение численности бактерий и резкие изменения в таксономической структуре сапротрофного бактериального блока. Эти изменения заключаются в замещении доминирующих в нативном мхе эккрисотрофных агробактерий бактериями гидролитического блока. Использование молекулярно-биологических методов для идентификации доминирующих в сфагнуме таксонов позволило выявить таких специфических бактерий-гидролитиков как Janthinobacte-rium agaricum и Streptomyces purpurascens. Кинетический метод определения физиологического состояния бактерий in situ показал большее функциональное разнообразие бактерий-гидролитиков в сообществе измельченного мха по сравнению с нативным. Значительное уменьшение показателя C/N в измельченных образцах живого сфагнума, инкубируемых методом микрокосмов, свидетельствует о процессах деструкции этого субстрата.

Ключевые слова: сфагнум, механическое измельчение, численность и таксономическая структура бактериальных комплексов, физиологическая активность бактерий, деструкция сфагнума.

DOI: 10.7868/S0026365614060056

Верховые торфяники, обладая высокими запасами жизнеспособной микробной биомассы, характеризуются низкими темпами минерализации торфа. В качестве факторов, тормозящих деструкцию верхового торфа, большинство исследователей называют: низкую концентрацию кислорода, кислую реакцию среды, недостаток питательных элементов, низкие температуры, особый состав полисахаридов сфагнума и наличие фенолов [1—6]. В опубликованной нами в 2013 г. коллективной монографии "Функционирование микробных комплексов верховых торфяников — анализ причин медленной деструкции торфа" [7] рассматриваются все вышеназванные факторы. В результате были сделаны выводы, согласно которым на первых этапах деструкции сфагнума основным ограничивающим фактором является специфическая структура полисахаридов сфагнума, которые с трудом поддающихся разрушению даже грибами. Кроме того, длительному сохранению стеблей сфагнума способствуют низкие численность и

1 Автор для корреспонденции (e-mail: dobrtata@mail.ru).

разнообразие почвенных животных, функции которых — измельчать растительные ткани.

Влияние искусственного механического разрушения сфагнового мха на его химический состав было проведено химиками-торфоведами из Томска [8]. Было установлено, что измельчение сфагнового мха в мельницах способствует частичному ферментативному разрушению прочных гликозидных связей в полисахаридах, которые характерны для ненарушенного мха и снижению антиоксидантных свойств. Тем самым, сфагнум должен становиться более доступным для деструкции микроорганизмами гидролитического блока. Однако микробиологами этот факт пока не был проверен.

Целью настоящей работы было оценить в модельных экспериментах влияние механического измельчения сфагнума на эколого-таксономиче-скую структуру и физиологическую активность бактериальных сообществ, населяющих живой мох и очес.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования был верховой торфяник, являющийся одной из постоянных пробных

площадей Западнодвинского лесо-болотного стационара ФГБУН Института лесоведения РАН (56°09' с.ш., 32°10' в.д. и 56°09' с.ш., 32°08' в.д.) в Тверской области. Этот торфяник — часть болотного массива, формирование которого по данным радиоуглеродной датировки и спорово-пыльцевого анализа началось около 9000 лет назад, что соответствует началу бореального периода. По своему облику это классический болотный массив центрально-олиготрофного хода развития, находящийся на стадии резко выпуклого болота с облесенными склонами. Исследуемый торфяник расположен в верхней части одного из таких склонов под сосняком пушицево-сфагновым. Доминантами растительного покрова являются сфагнум магелланский (Sphagnum magellanicum) и сфагнум бурый (S. fuscum). Залежь сложена верховым торфом: до 1.5 м — слаборазложившимся (3—20%); от 1.5 до 4 м — среднеразложившимся (25—35%); от 4 до 4.5 — переходным торфом; от 4.5 до 5 м — низинным торфом и подстилается органо-мине-ральными отложениями. Значение рН варьирует по профилю от 2.8 до 4.5.

Для определения влияния механического измельчения сфагнума на численность, структуру и физиологическую активность бактериальных комплексов из исследуемого торфяника был взят монолит, объемом 50 см х 50 см х 30 см. Из монолита были аккуратно извлечены стебли сфагнума и разделены на две части: верхняя зеленая часть растения длиной около 5 см (живой сфагнум) и нижняя часть растения желтовато-бурого цвета длиной около 10 см (очес сфагнума). Живой сфагнум и его очес были помещены в отдельные вегетационные сосуды и получили статус контрольных образцов. Следующими вариантами для изучения были образцы живого сфагнума и его очеса, подвергшиеся механическому измельчению ножницами до крупнодисперсных частиц длиной 5—7 мм (крупнодисперсные образцы), и образцы живого сфагнума и его очеса, подвергшиеся механической обработке на пропеллерной мешалке-миксере (микроизмельчитель тканей РТ-2, 5000 об./мин) до мелкодисперсных частиц длиной 0.5—0.7 мм (мелкодисперсные образцы). Средний вес образцов в вегетационных сосудах составлял около 1 кг. Отбор и анализ образцов для проведения микробиологического анализа производили на 0, 3, 7, 14, 30, 60, 90, 120, 150, 180-е сут. На всех стадиях сукцессии модельных опытов осуществляли контроль влажности.

Численность бактерий определяли прямым методом с использованием люминесцентной микроскопии [9]. Для исследования отбирали 1 г образца и помещали в колбу со 100 мл стерильной воды. Для десорбции клеток полученную суспензию обрабатывали на ультразвуковом дисперга-торе Bandelin Sonopuls HD 2070 (Германия) в те-

чение 2 мин при мощности 50%. Суспензию (0.01 мл) наносили микропипеткой на предметное стекло и равномерно распределяли петлей на площади 4 см2. Для одного образца готовили 6 препаратов. На каждом препарате просматривали по 20 полей зрения. Окрашенные акридином оранжевым препараты просматривали на люминесцентном микроскопе ЛЮМАМ-ИЗ (Россия) (светофильтры ЖС-19, ЖС-18, объектив х90 Л, окуляры х4 или х5).

Количество клеток бактерий, содержащихся в 1 г свежего образца, вычисляли по формуле: N = = S1an/vS2c, где: N — число клеток бактерий в 1 г свежего образца; S1 - площадь препарата (мкм2); а — среднее число бактерий в поле зрения; n — показатель разведения суспензии (мл); v — объем капли, наносимой на стекло (мл); S2 — площадь поля зрения микроскопа (мкм2); с — навеска образца (г). Удельную массу микроорганизмов принимали равной 1 г/см3; содержание воды в клетках — 80%.

Осуществляли пересчет количества бактериальных клеток на 1 г сухого образца. Влажность определяли, высушивая образцы при 105°С в течение 6 ч.

Численность и таксономический состав бактерий сапротрофного блока определяли методом посева на агаризованную глюкозо-пептонно-дрож-жевую среду (ГПД). Для ингибирования роста грибов в среду добавляли 50 мг нистатина на 0.5 л среды. Для посева использовали суспензию, оставшуюся после приготовления препаратов для люминесцентной микроскопии. Посев проводили в 5-кратной повторности из экспериментально подбираемых 10-кратных разведений. Посевы инкубировали при комнатной температуре в течение 2—3 недель. Общую численность бактерий выражали в колониеобразующих единицах (КОЕ) на 1 г образца. Проводили дифференцированный учет колоний бактерий разных таксономических групп. Основных представителей бактерий выделяли в чистую культуру. Идентификацию выделенных штаммов до рода проводили на основании морфологических, культуральных и хемотаксоно-мических признаков [10, 11]. Идентификацию доминирующих таксонов бактерий проводили по результатам секвенирования нуклеотидных последовательностей гена 16S рДНК с использованием программы BLAST [12].

Физиологическую активность бактерий определяли кинетическим методом [13, 14]. Бактерии десорбировали из образца вортэксированием суспензии 1 : 5 (2000 об./мин, 20 мин) и центрифугированием (3075 g, 5 мин). Используемый в качестве инокулята супернатант раскапывали по 100 мкл в ячейки 96-луночных планшет. В ячейки предварительно были внесены минеральная основа среды Чапека (100 мкл), нистатин (2 мг/л) (для ингибирования роста грибов) и различные биопо-

лимеры (карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ), крахмал, пектин, ксилан, хитин, казеин, декстран-500) из расчета 10 г/л. Далее планшету инкубировали при 25°С в иммунно-ферментном анализаторе "Sunrise" (Швейцария) в режиме автоматического встряхивания в течение 150—170 ч, и определяли рост бактерий по оптической плотности суспензии (X = 620 нм).

Параллельно проводили высев на ГПД среду из инокулята (для определения начальной концентрации бактерий), а также из содержимого ячеек по окончании инкубирования для: 1) подтверждения корреляции между оптической плотностью и концентрацией клеток в ячейках, а также 2) выявления физиологических групп бактерий, которые росли на определенных полимерах.

На основании уравнения корреляции между оптической плотностью популяций, выросших в ячейках, и концентрацией в них клеток были получены кинетические параметры, описывающие рост бактерий согласно уравнению: x(t) =

= x0(1 - r0 + r0eцmt), где x(t) — концентрация клеток (КОЕ/мл) в момент времени t, x0 — начальная концентрация клеток, r0 — начальное значение переменной физиологического состояния микроорганизмов, цт — максимальная удельная скорость роста микроорганизмов. В работе активность определяли как —ln(r0): чем она больше, тем активность меньше.

Эффективность ассимиляции субстрата определяли по отношению прироста бактерий в жидких средах (КОЕ) к исходной концентрации полимера.

Процентн

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком