БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2013, том 30, № 4, с. 304-312
УДК 577.231
ВЛИЯНИЕ МЕЛАТОНИНА НА ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ Сa2+-ИНДУЦИРОВАННОЙ НЕСЕЛЕКТИВНОЙ ПОРЫ МИТОХОНДРИЙ ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫС ПРИ СТАРЕНИИ © 2013 г. О. В. Крестинина*, И. В. Одинокова, Ю. Л. Бабурина, Т. С. Азарашвили
Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290, Пущино, Московская обл., Институтская ул., 3; *электронная почта: krestinina@rambler.ru Поступила в редакцию 17.02.2013 г.
Старение сопровождается дисфункцией митохондрий, связанной со снижением активности дыхательных комплексов и уменьшением АТР-синтетазной активности, а также с усилением окислительного стресса и увеличением чувствительности к индукции неспецифической митохондриаль-ной поры, запускающей программируемую гибель клеток. Изучено влияние природного антиокси-данта мелатонина на параметры Са2+-индуцированной неселективной поры несинаптических митохондрий, изолированных из головного мозга крыс разного возраста. Мелатонин добавляли непосредственно к митохондриям, а также длительно вводили орально с питьевой водой. Показано, что митохондрии, выделенные из головного мозга старых животных, обладают повышенной чувствительностью к индукции неспецифической поры. Мелатонин, добавленный к суспензии митохондрий, выделенных из мозга молодых крыс, оказывал проапототический эффект. Антиапототи-ческий протекторный эффект мелатонина наблюдали при его длительном введении старым животным. В этом случае изолированные митохондрии демонстрировали устойчивость к возникновению неспецифической митохондриальной поры и активацию дыхания.
Ключевые слова: митохондрии, хроническое введение мелатонина, пора неспецифической проницаемости, старение.
Б01: 10.7868/80233475513040051
Нарушение функций митохондрий считается важным фактором, связанным со старением, ишемией/реперфузией, септическим шоком, а также с нейродегенеративными изменениями, наблюдаемыми при болезнях Паркинсона, Альц-геймера и Хантингтона. К факторам, ответственным за нарушение функций митохондрий, относят увеличение продукции активных форм кислорода (АФК) и активацию индуцибельной МО-синтазы, а также снижение активности ферментов дыхательной цепи и индукцию открытия неспецифической митохондриальной поры (мРТР). Митохондрии являются основным внутриклеточным источником АФК, но, генерируя АФК, они сами становятся их мишенями. Под действием АФК в митохондриях происходит повреждение электронно-транспортной цепи (ЭТЦ) и накопление мутаций в митохондриальной ДНК [1—3]. Окислительный стресс и снижение активности кальций-транс-портирующей системы считаются важными факторами дисфункции митохондрий, связанными со старением [4, 5]. Кроме того, в ответ на окислительный стресс или при достижении в матрик-се митохондрий сверхпороговых концентраций
кальция происходит увеличение проницаемости внутренней мембраны (permeability transition) и формируется мРТР, через которую происходит обмен соединениями с молекулярной массой до 1—1.5 кДа между митохондриальным матриксом и цитозолем [6]. Са2+-индуцированное открытие поры приводит к деполяризации внутренней мембраны, разобщению дыхания и фосфорили-рования, а также к набуханию митохондрий и выходу проапоптотических факторов. Повышенная чувствительность к открытию мРТР, т.е. снижение пороговой концентрации кальция, выявлена в митохондриях, изолированных из различных тканей старых животных, таких как печень, головной мозг и сердце [7—10]. Точный механизм, лежащий в основе возраст-зависимых митохон-дриальных изменений, пока не установлен. Однако большое внимание уделяется повышению защитной реакции на окислительный стресс с помощью различных антиоксидантов, чтобы уменьшить возраст-зависимые окислительные повреждения и дисфункцию митохондрий [11]. Среди эффективных антиоксидантов следует отметить нейрогормон мелатонин, вырабатывае-
мый шишковидной железой (эпифизом), антиок-сидантные свойства которого были открыты Таном в 1993 году [12]. Мелатонин — высоко липофильная молекула, которая проникает через клеточные мембраны, легко достигая субклеточных структур [13]. В процессе старения уровень мелатонина резко снижается, а следовательно, ослабляются его защитные свойства. Мелатонин обнаружен в клеточном ядре и в митохондриях. В митохондриях мелатонин накапливается в высоких концентрациях [14]. Мелатонин способен взаимодействовать с липидным бислоем митохондрий и предотвращать перекисное окисление кардиолипина в нем [15], что приводит к стабилизации внутренней митохондриальной мембраны [16]. Показано также, что мелатонин улучшает активность ЭТЦ, снижая образование АФК на уровне комплексов I, III, IV [17]. Влияние мела-тонина на функционирование мРТР до настоящего времени изучено недостаточно, а полученные результаты противоречивы [18, 19]. Так, показано, что в митохондриях из сердца, обработанного мелатонином, мРТР открывалась при более высоких пороговых концентрациях кальция, чем в контрольных митохондриях. Эффект мелатонина был сравним с эффектом циклоспорина А (специфического блокатора поры), т.е. мелатонин обладал антиапоптотическими свойствами [20]. С другой стороны, обнаружен проапоптотический эффект мелатонина на митохондрии печени [18]. Оказалось, что в присутствии кальция мелатонин в микромолярных концентрациях способен индуцировать открытие мРТР. Исследовали также как влияет на состояние митохондрий модельных мышей SAM8, у которых наблюдается ускоренное старение (senescence accelerated mouse), длительное введение мелатонина с питьевой водой. Ускоренное старение этих мышей было обусловлено воздействием окислительного стресса. Оказалось, что введение природного антиоксиданта мелатонина улучшало функции митохондрий головного мозга при старении, т.е. снижало перекисное окисление кар-диолипина, увеличивало активность ферментов дыхательной цепи на уровне комплексов II, III и IV и восстанавливало соотношение восстановленного и окисленного глутатиона (GSH/GSSG) в митохондриях.
Однако в подобных опытах не определяли как влияет мелатонин на состояние мРТР, поэтому мы сравнили действие мелатонина на параметры Са2+-зависимой CsA-чувствительной поры при старении. С этой целью мелатонин добавляли непосредственно к суспензии изолированных митохондрий, а также определяли параметры мРТР в митохондриях, выделенных из старых животных, которые длительно получали мелатонин с питьевой водой.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В настоящей работе митохондрии выделяли из головного мозга крыс линии Вистар — молодых (половозрелых, 3-месячных) и старых (18-месячных).
Хроническое введение мелатонина и выделение митохондрий из головного мозга крысы. Функциональное состояние митохондрий крыс, длительно получавших мелатонин (Sigma, США), изучали с использованием четырех групп животных: группа 1 — молодые крысы, не получавшие мелатонин; группа 2 — молодые крысы, получавшие мелатонин; группа 3 — старые крысы, не получавшие мелатонин, и группа 4 — старые крысы, обработанные мелатонином. Мелатонин добавляли в питьевую воду, которую давали животным. Животных второй (1 мес) и четвертой группы (16 мес) в течение 2 месяцев поили водой с мелатонином (хроническое введение). Мелатонин готовили следующим образом: навеску из расчета 150 мкг/мл растворяли в питьевой воде (растворимость мела-тонина в воде составляет 10 г/л). Объем воды, выпиваемой каждой крысой, — 33 ± 3 мл, что составляло приблизительно 10 мг мелатонина на 1 кг веса в день. Животных содержали в одинаковых условиях (температура, влажность воздуха, кормление) [21]. Далее из головного мозга крыс каждой группы выделяли митохондрии по методу Симса [22], модифицированному в нашей лаборатории. Изолированный мозг измельчали, очищали от кровеносных сосудов и разрушали в десятикратном объеме среды, содержавшей 320 мМ сахарозу, 10 мМ трис-HCl (pH 7.4), 0.5 мМ К+-EDX^ 0.5 мМ EGТА, 0.2% БСА (все реактивы Sigma, США), с помощью стеклянного гомогенизатора. Гомогенат центрифугировали при 2000 g в течение 3 мин, осадок удаляли, а супернатант центрифугировали повторно для более полного удаления ядер и поврежденных клеток. Осадок митохондрий, полученный центрифугированием при 12500 g (10 мин, 4°С), смешивали с 1 мл 3% перкола (Sigma, США). Далее митохондрии очищали в градиенте перкола (10—15—24%). Полученные несинаптические митохондрии осаждали при 31300 g в течение 10 мин, промывали при 11500 g (10 мин) средой выделения, не содержащей EDТА, EGТА и БСА (все реактивы Sigma, США), и суспендировали в той же среде. Таким образом, получали гомогенные препарат митохондрий головного мозга. Чистоту препарата ранее проверяли методами электронной микроскопии [10]. Все процедуры проводились при температуре 4°С.
Определение функций митохондрий. Параметры функционирования неспецифической поры измеряли в термостатируемой ячейке, в которую вмонтированы селективные электроды: ТРР+, Са2+ и кислородный электрод Кларка (Нико, Россия) [23]. Среда измерения содержала 10 мМ
трис-НС1-буфер рН 7.4, 120 мМ KCl, 0.4 мМ KH2PO4, 5 мМ сукцината калия и 2.5 мкМ роте-нона (все реактивы Sigma, США). Сукцинат калия использовали как субстрат для дыхания митохондрий. Концентрация белка в ячейке составляла 1 мг/мл. Открытие мРТР в митохондриях индуцировали пороговой концентрацией Са2+, которую устанавливали для каждого препарата митохондрий. Первое добавление Са2+ составляло 50 нмоль/мг белка, все последующие — 75 нмоль/мг белка. Все эксперименты выполняли в открытой ячейке. Для статистического анализа брали среднее значение параметров, вычисленное по результатам трех—четырех опытов ± SD. Статистическую значимость подсчитывали с использованием i-кри-терия Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Как упомянуто ранее, результаты, полученные при изучении влияния мелатонина на митохондрии, противоречивы. В нашей работе мелатонин в концентрации 100 нмоль/мг белка использовали как для изучения его влияния непосредственно на изолированные несинаптические митохондрии мозга, так и при хроническом его введении с питьевой водой. Сравнительный анализ параметров функционирования мРТР проводили как описано ранее [23] и в Материалах и Методах.
Основны
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.