МИКРОБИОЛОГИЯ, 2012, том 81, № 3, с. 396-402
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 577.152.321
ВЛИЯНИЕ МЕТАБОЛИТОВ БУРЫХ ВОДОРОСЛЕЙ НА СИНТЕЗ О-ГЛИКОЗИЛГИДРОЛАЗ БАКТЕРИЯМИ, ДЕГРАДИРУЮЩИМИ ТАЛЛОМ FUCUS EVANESCENS
© 2012 г. С. П. Ермакова*, Е. П. Иванова**, И. Ю. Бакунина*, В. В. Михайлов*, Т. Н. Звягинцева*
*Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН, Владивосток **Свинбурнский Технологический институт, Мельбурн Поступила в редакцию 30.05.2011 г.
Исследовано действие фукоидана, экстрактивных веществ из Fucus evanescens, белка из Laminaria d-chorioides (ингибитора эндо-1^-3-Р^-глюканаз) на разложение таллома F. evanescens и рост бактерий, участвующих в этом процессе. Комплекс О-гликозилгидролаз у бактерий, культивируемых в различных условиях, и уровень их ферментативной активности значительно зависели от состава среды. Наибольшее таксономическое разнообразие наблюдалось для бактерий, выделенных из таллома, деградированного в контрольной среде (морской воде). Особенностью этих бактерий являлось практически полное отсутствие активности ферментов деградации полисахаридов (фукоидана, ламинарана, пустулана). В присутствии веществ, ингибирующих активность 1^3-Р-Б-глюка-назы, наблюдалось уменьшение таксономического разнообразия микроорганизмов, деградирующих таллом F. evanescens, а также увеличение активности О-гликозилгидролаз, в частности, фукоидангидролаз.
Ключевые слова: О-гликозилгидролазы, бурые водоросли, морские микроорганизмы, ингибитор эн-до-1^-3-Р-В-глюканаз.
Нормальное функционирование любого растительного и животного организма зависит от эффективной работы ферментов. Осознание ключевой роли ферментов во всех клеточных процессах привело к широкому их применению в медицине, фармакологии, токсикологии. В основе действия многих токсических веществ лежит их способность ингибировать ферменты; таким же эффектом обладает и ряд лекарственных препаратов.
Большой интерес вызывают ингибиторы О-гли-козилгидролаз, выделенные из природных источников. Наиболее исследованы природные ингибиторы а-амилаз и гликозидаз [1—4]. Изучается участие амилазных ингибиторов, выделенных из злаковых, во взаимоотношениях растение/насекомые, растение/животные или растение/микроорганизмы [5, 6].
Бурые водоросли представляют собой богатый источник различных полисахаридов — фукоидана, ламинарана и альгиновой кислоты [7—9]. Морские микроорганизмы филлопланы водорослей (эпибионтные) могут разлагать таллом благодаря наличию комплекса О-гликозилгидролаз, способных деполимеризовать полисахариды бурых водорослей.
1 Автор для корреспонденции (e-mail: swetlana_e@mail.ru).
Ранее нами было показано, что бурые водоросли содержат вещества, обладающие ингибирующим действием по отношению к эидо-1^3-Р^-глюка-назам морских моллюсков и микроорганизмов [10]. Эти ферменты являются пищеварительными и катализируют гидролиз ламинаранов — 1^3; ^ó-P-D-глюканов, резервных полисахаридов бурых водорослей [7, 11, 12]. Нами выделен из бурой водоросли Laminaria cichorioides ингибитор белковой природы необратимого типа действия, высокоспецифичный к эндо-1^3-Р^-глюканазам морских моллюсков: ингибирующее действие (I50 ~ 10~8 М) для него сопоставимо с действием синтезируемых наземными растениями ингибиторов а-амилаз пищеварительного тракта травоядных животных [10]. Представляет интерес выяснение роли подобных веществ в сосуществовании водоросль/морские микроорганизмы.
Наряду с 1^3-Р^-глюканазами ферментативный комплекс включает альгинат-лиазы, a-L-фукозидазы, а- и P-D-галактозидазы, P-D-глю-козидазы и другие ферменты [13]. Что касается фукоидангидролаз, ферментов, действующих на другие распространенные полисахариды клеточных стенок бурых водорослей — фукоиданы (семейство сульфатированных a-L-фуканов и гете-
рополисахаридов), обладающие разнообразным биологическим действием [14, 15], то уровень их активности в морских организмах чрезвычайно низок [16]. Имеются лишь единичные работы по выделению и изучению фукоиданаз, в том числе и из бактерии Flavobacterium sp. SA-0082 [17]. Фермент, выделенный из этой бактерии, уже используется для деполимеризации фукоидана (с целью увеличения биологической активности) при получении лечебно-профилактических напитков [17]. Сведения о природных ингибиторах этих ферментов отсутствуют.
Цель данной работы — изучение микробной деградации бурой водоросли Fucus evanescens, состава микробного сообщества и ферментативной активности симбиотрофных бактерий, участвующих в разложении таллома водоросли в морской воде; исследование действия фукоидана, экстрактивных веществ из F. evanescens, белка из Laminaria ti-chorioides (ингибитора эндо-1^3-Р-Э-глюканаз) на разложение таллома F. evanescens.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Методы. Нейтральные сахара из биомассы бактерий определяли фенол-сернокислотным методом [18], восстанавливающие сахара при определении активности ферментов регистрировали с помощью метода Нельсона [19].
Субстраты. Ферментативную активность бактерий определяли с помощью следующих субстратов. Ламинаран и фукоидан из бурой водоросли L. cichorioides, пустулан из лишайника Umbilicaria rossica были получены с помощью ранее описанных методов [15]. Также использовали р-нитро-фенильные производные P-D-глюко- ^NO2Ph-P-D-Glc], P-D-N-ацетилглюко- ^NO2Ph-P-D-NAcGlc], a-D-манно- ^NO^h-a-D-Man], a- и P-D-галакто- ^NO2Ph-a- и P-D-Gal], a-L-фуко-^NO2Ph-a-L-Fuc] и P-D-ксилопиранозидов ^NO2Ph-P-D-Xyl], а также агар — коммерческие препараты.
Получение экстрактов и метаболитов водорослей. Водоросли были собраны в экспедициях НИС "Академик Опарин" (F. evanescens, о. Итуруп, Охотское море) или на Морской экспериментальной станции Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН (L. cichorioides, Хасанский район Приморского края), в августе— сентябре 1999 г. Свежесобранные или замороженные водоросли измельчали и обрабатывали этанолом (1 : 1) при комнатной температуре в течение 2 недель. Спиртовые экстракты концентрировали под вакуумом досуха, сухой остаток использовали для дальнейших исследований. Фукоидан из F. evanescens выделяли по методу [20]. Белковый ингибитор выделяли из водноспиртового экстрак-
та L. cichorioides согласно ранее описанному методу [10].
Микроорганизмы и условия культивирования.
Выделение микроорганизмов из деградированных образцов таллома бурой водоросли F. evanescens, а также определение их таксономического положения было выполнено согласно методам, описанным в опубликованной ранее работе [21] с некоторыми модификациями. Для разложения таллома куски водоросли F. evanescens (5 г) промывали стерилизованной морской водой и помещали в стеклянные колбы с 200 мл стерильной среды: морская вода, рН 7.5—7.8 (контрольная среда, среда К), и с добавками к контрольной среде: фукоидана — 1 г/л (среда 1); белкового ингибитора ламинариназ из L. cichorioides — 0.4 мг/л (среда 2); экстрактивных веществ из F. evanescens — 0.4 мг/л (среда 3). Колбы инкубировали в статических условиях при температуре 25°С в течение 2 месяцев.
Выделение монокультур бактерий проводили на агаризованных средах с помощью стереоскопического микроскопа Carl Zeiss с 1000-кратным увеличением. Культивирование проводили при температуре 20—22°С. Бактерии идентифицировали согласно стандартным методам и как описано ранее [22, 23]. Чистые культуры поддерживали на столбиках с полужидкой агаризованной (5 г агара на 1 л среды) средой указанного выше состава под минеральным маслом при 4°С и в жидкой среде с 20% глицерина при —80°С. В настоящее время штаммы КММ 3553 и КММ 3773 хранятся в Коллекции морских микроорганизмов (КММ) ТИБОХ ДВО РАН.
Для первичного скрининга ферментов бактерии выращивали в питательных средах следующего состава (г/л): бактопептон ("Difco") — 5.0, дрожжевой экстракт ("Difco") — 2.0, K2HPO4 — 0.2. MgSO4 — 0.05, а также морская вода — 100 мл, рН 7.5—7.8 (контрольная среда, К) и с добавками к контрольной среде фукоидана — 1 г/л (среда 1); белкового ингибитора ламинариназ из L. cichorio-ides — 0.4 мг/л (среда 2); экстрактивных веществ из F. evanescens — 0.4 мг/л (среда 3). Бактерии культивировали на термостатированной качалке (160 об/мин) при температуре 28°С.
Определение активности ферментов. К бактериальному экстракту (0.01 мл) добавляли раствор соответствующего субстрата (0.1 мл, 1 мг/мл) и 0.14 мл 0.05 М натрий-фосфатного буфера, рН 7.0. Смесь инкубировали при 37°С в течение 1—4 ч. Активность ферментов, гидролизующих полисахариды (фукоидан, ламинаран, пустулан), определяли по увеличению количества восстанавливающих сахаров методом Нельсона. Активность гликози-даз (субстраты — ^-нитрофенильные производные соответствующих сахаров) определяли по количеству выделившегося ^-нитрофенола [24]. За
единицу активности принимали количество фермента, которое катализировало образование глюкозы (1 мкмоль) или ^-нитрофенола за 1 мин в условиях определения.
Ингибирование бактериальных ламинариназ.
Раствор белкового ингибитора из L. cichorioides 0.01 мл (1 мкг вещества) в 0.05 М фосфатном буфере, рН 7.0, и 0.01 мкл фермента (10-2 ед./мл) выдерживали в течение 10 мин при 37°С, затем добавляли 0.1 мл ламинарана (1 мг/мл) и 0.13 мл 0.05 М фосфатного буфера, рН 7.0, инкубировали 30 мин при 37°С и определяли остаточную активность фермента по количеству восстанавливающих сахаров. В качестве положительного контроля при определении ингибиторов использовали 1^3-Р-Э-глюканазу Л1У из Spisula sachalinensis (10-2 ед./мл) [10].
Получение экстрактов из бактерий. Клеточную биомассу бактерий (0.4 г) суспендировали в 3 мл 0.05 М натрий-фосфатного буфера, рН 7.0, обрабатывали на ультразвуковом дезинтеграторе УЗНД-2, центрифугировали (10000 g, 30 мин, 4°С). Супернатант исследовали на содержание ферментов: ламинариназ, агараз, фукоидангид-ролаз, пустуланаз, а-галактозидаз, Р-галактози-даз, Р-гликозидаз, P-N-ацетилглюкозаминидаз, а-маннозидаз, а-фукозидаз, Р-ксилозидаз (как описано выше).
Получение частично очищенных препаратов ламинариназ. Экстракт бактерий (5 мл) наносили на колонку Sephadex G-75 (50 х 1 см), уравновешенную 0.05 М фосфатным буфером, р
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.