ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2015, том 62, № 2, с. 212-221
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ =
УДК 581.1
ВЛИЯНИЕ МЕТИЛЖАСМОНАТА НА РОСТОВЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ СУСПЕНЗИОННОЙ КУЛЬТУРЫ ГРЕЧИХИ ТАТАРСКОЙ И НАКОПЛЕНИЕ
В НЕЙ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ © 2015 г. Е. А. Гумерова*, А. Н. Акулов***, Н. И. Румянцева*
*Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Казанский институт биохимии и биофизики
Казанского научного центра РАН, Казань **Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования
Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань Поступила в редакцию 28.05.2014 г.
Исследовали влияние метилжасмоната (МеЖ) в концентрациях 0.01, 0.1, 1 и 10 мкМ на следующие физиолого-биохимические характеристики суспензионной культуры гречихи татарской (Fagopyrum ?Шапсыт (Ь.) ОаегШ.): рост, морфогенез, содержание фенольных соединений (ФС) и антиоксидант-ную активность (АОА). Методом ВЭЖХ проведен качественный и количественный анализ ФС, который выявил, что суспензионная культура гречихи татарской при культивировании в темноте синтезирует рутин, кверцитрин, эпикатехин, феруловую и п-кумаровую кислоты, из которых рутин является наиболее представленным соединением. Показано, что МеЖ не оказывал угнетающего воздействия на рост суспензионной культуры и стимулировал образование ФС, особенно на средах с добавлением 1 и 10 мкМ МеЖ. С увеличением концентрации МеЖ при увеличении содержания ФС наблюдали снижение АОА, что, вероятно, обусловлено развитием в суспензионной культуре окислительного стресса. МеЖ в концентрации 10 мкМ незначительно стимулировал нарастание биомассы, но после пассажа на среде с 10 мкМ МеЖ суспензионная культура почти полностью теряла способность к образованию эмбриоидов на безгормональной среде. Показано, что выращивание культуры на среде с 10 мМ МеЖ не только приводило к увеличению общего содержания ФС, но и изменяло их качественный состав, а также содержание определенных представителей ФС. Содержание эпикатехина было выше, чем в контроле, на протяжении всего пассажа; увеличение содержания п-кумаровой кислоты и рутина отмечали на 4-8-е сутки, а кверцитрина — на 8-14-е сутки. Активация синтеза этих соединений наблюдалась не к концу пассажа, как в контроле, а на более ранних сроках культивирования. Следует отметить резкое увеличение уровня внутриклеточной фе-руловой кислоты (при ее следовых количествах в контроле), отмеченное только на 4-е сутки культивирования. Установлено, что МеЖ по-разному активировал биосинтез отдельных представителей ФС: усиление накопления эпикатехина, п-кумаровой и феруловой кислот было более значительным, чем рутина и кверцитрина. Помимо пиков идентифицированных ФС МеЖ стимулировал появление пиков новых соединений, отсутствующих или слабо выраженных в контроле.
Ключевые слова: Fagopyrum (а(апсыт - суспензионная культура - метилжасмонат - фенольные соединения — антиоксидантная активность — морфогенная способность
БО1: 10.7868/80015330315020074
ВВЕДЕНИЕ
Фенольные соединения (ФС) играют важную роль в растительном метаболизме и выполняют различные функции: защиту от УФ-излучения,
Сокращения: АОА - антиоксидантная активность; АТ - 3-ами-но-1,2,4-триазол; ДФПГ - 2,2-дифенил-1-пикрилгидразил; МеЖ — метилжасмонат; ПЭКК — проэмбриональный клеточный комплекс; ФС - фенольные соединения. Адрес для корреспонденции: Румянцева Наталья Ивановна. 420111 Казань, ул. Лобачевского, 2/31, а/я 30. ФГБУН Казанский институт биохимии и биофизики КазНЦ РАН, лаборатория физиологии и генетики культивируемых клеток. Факс: +7(843) 292-73-47; электронная почта: nat_rumyantseva@mail.ru
низких температур, поранения, патогенных атак; они также участвуют в сигналлинге и регуляции роста и развития растений [1].
Гречиха является одним из лучших источников полифенольных соединений. Активный синтез ФС - характерная особенность вторичного метаболизма как гречихи посевной (Fagopy-гыт езсы1епШт МоепеИ), так и гречихи татарской (^ 1а1апсыт (Ь.) Gaertn.). В отличие от гречихи посевной использование гречихи татарской в пищу ограничено в первую очередь ее более горьким вкусом. Тем не менее, зерно гречихи татарской содержит большее, чем у гречихи посевной, количество белка, витаминов В1, В2 и В6. Качествен-
ный состав флавоноидов проростков гречихи посевной и татарской различаются, обнаруживая свой уникальный "фингерпринт" [2]. Содержание основного флавоноида - рутина - в плодах гречихи татарской в 50-60 раз, а в проростках в 5 раз выше, чем в гречихе посевной [3]. ФС гречихи татарской обладают сосудоукрепляющим, противовоспалительным, гипотензивным, противоотечным, антидиабетическим и антиаллергическим действием, они снижают уровень холестерола, а также обладают антиопухолевой активностью [4].
Культивируемые in vitro клетки могут быть использованы как объект для изучения регуляции фенольного метаболизма, транспорта ФС и исследования их функций, а также в практических целях для производства ФС, обладающих высокой биологической активностью. Известно, что условия культивирования клеток in vitro, а также стрессовые воздействия (свет, температура, засоление, ионы тяжелых металлов, прооксиданты и др.) способны вызывать значительные изменения во вторичном метаболизме культивируемых клеток [5, 6].
Жасмонаты (жасмоновая кислота и ее производные, в том числе метилжасмонат (МеЖ)) — это сигнальные молекулы растений, которые являются продуктами липоксигеназного окисления а-линоленовой кислоты, высвобождаемой из мембран пластид при действии липаз в ответ на поранение и атаку насекомых и патогенов [6]. К настоящему времени накоплен обширный материал, свидетельствующий о том, что жасмона-ты участвуют в регуляции многих процессов у растений: вегетативном развитии, контроле фер-тильности, созревании, старении и регуляции клеточного цикла (см. обзоры [6, 7]). Жасмонаты вовлечены в развитие устойчивости растений к широкому кругу биотических стрессоров — насекомым, грибам, вирусам, нематодам и паразитическим растениям [7]. Известно также, что уровень жасмоната увеличивается в ответ на ряд абиотических воздействий, вызывающих окислительный стресс [6, 8, 9]. Экзогенно добавленный МеЖ, так же как и поранение, активирует транскрипцию генов, вовлеченных в реализацию комплекса защитных реакций у растений [8]. Наиболее сильное влияние МеЖ оказывает на регуляцию вторичного метаболизма, стимулируя накопление алкалоидов, терпеноидов, фенолов, кумаринов, таксанов, глюкозинолатов (и, соответственно, токсичных продуктов их гидролиза), обладающих антимикробной, антифунгицидной, инсектицидной, антиоксидантной активностью (АОА) [7]. ФС относятся к группе наиболее сильных неферментативных антиоксидантов, обладающих целым рядом полезных для человека свойств. Показано, что МеЖ активирует феноль-ный метаболизм не только в целых растениях, но и в клеточных культурах растений [10]. Имеются
отдельные работы по влиянию МеЖ на феноль-ный метаболизм проростков гречихи посевной [11, 12]. Тем не менее, нам не известны работы, в которых исследовали влияние МеЖ на феноль-ный метаболизм культивируемых клеток гречихи.
Цель нашей работы состояла в изучении влияния МеЖ на ряд физиолого-биохимических характеристик суспензионной культуры гречихи татарской: рост, морфогенез, содержание феноль-ных соединений и АОА.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объект исследования. Использовали морфо-генную суспензионную культуру клеток Fagopy-rum tataricum (L.) Gaertn., полученную из морфо-генного каллуса путем его перевода с твердой на жидкую среду RX, содержащую макро- и микросоли по В5 [13], 100 мг/л мезоинозита, 2.0 мг/л ти-амина-HCl, 1.0 мг/л пиридоксина-HCl, 1.0 мг/л никотиновой кислоты, 2000 мг/л гидролизата казеина, 2.0 мг/л 2,4-Д, 0.5 мг/л ИУК, 0.5 мг/л НУК, 0.2 мг/л кинетина, 25 г/л сахарозы, рН 5.6. Для поддержания суспензионной культуры использовали фракцию проэмбриональных клеточных комплексов (ПЭКК) размером 0.5-1.0 мм, которую получали, используя соответствующее сито, промывали свежей средой и культивировали при начальной плотности инокулята 150 мг в 20 мл среды в конических колбах объемом 100 мл, в темноте, на шейкере (130 об./мин, Multitron Standart, "Infors AG", Швейцария) при температуре 26°С. Длительность пассажа равнялась 14 дням. Конечная концентрация МеЖ в среде культивирования составляла 0.01, 0.1, 1 и 10 мкМ. Экспериментальные данные снимали: (а) в конце пассажа (14-е сутки) и (б) в динамике (4-, 8- и 14-е сутки культивирования).
Для определения морфогенной активности суспензионной культуры 100 мг фракции ПЭКК размером 0.5-1.0 мм переносили в чашки Петри на ватные диски, покрытые нейлоновой сеткой, затем добавляли 20 мл жидкой безгормональной среды (МСб/г) следующего состава: половинное содержание макросолей по МС [14], микросоли по МС, 2.0 мг/л тиамина • HCl, 1.0 мг/л пиридоксина-HCl, 1.0 мг/л никотиновой кислоты, 100 мг/л мезоинозита, 30 г/л сахарозы, рН 5.6. Чашки Петри с высаженными ПЭКК культивировали на свету (5 клк) с фотопериодом 16/8 ч (свет/темнота). Морфогенную активность культуры оценивали по количеству ПЭКК, образовавших соматические зародыши, в пересчете на 1 г.
Для получения экстракта биомассу суспензионной культуры отделяли от среды, лиофильно высушивали и вычисляли сухой вес. Сухую ткань растирали, к навеске (25 мг) добавляли 1.5 мл 80% метанола и инкубировали на водяной
бане при температуре 80°С в течение 30 мин. Полученный экстракт центрифугировали при 12000 g в течение 10 мин. Супернатант использовали для определения общего содержания ФС и АОА.
Жизнеспособность каллусных культур определяли на основании различной способности мертвых и живых клеток окрашиваться 0.025% водным раствором Эванса синего и удерживать его после промывания клеток дистиллированной водой [15]. К 100 мг отделенной от среды ткани добавляли на 15 мин 0.5 мл 0.025% водного раствора Эванса синего. От несвязанного красителя образцы тщательно отмывали дистиллированной водой. Связанный клетками краситель вымывали 1% раствором ДДС (на 50% этаноле) на водяной бане при 60°С в течение 30 мин, затем центрифугировали 10 мин при 12 000 g. Оптическую п
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.