УДК 577.175.82.05: 612.112.94
ВЛИЯНИЕ МИЕЛОПЕПТИДА-1 НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ ФАГОЦИТОВ МЫШЕЙ, ОБРАБОТАННЫХ ЦИКЛОФОСФАНОМ
© 2013 г. Е. А. Кирилина*, #, Т. Б. Мастернак**, М. А. Ефремов*, О. Ю. Камышников**
*ФГБУНИнститут биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,
117997, Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 **ФГБУ Государственный научный центр "Институт иммунологии" Федерального медико-биологического агентства России, 115478, Москва Поступила в редакцию 29.01.2013 г. Принята к печати 25.03.2013 г.
Изучена способность пептида костномозгового происхождения миелопептида-1 (МП-1) влиять in vivo и in vitro на функциональную активность фагоцитов здоровых и подвергнутых цитостатиче-скому воздействию (введению циклофосфана) мышей. Выявлен корригирующий эффект МП-1 in vitro на функциональную активность фагоцитов костного мозга и периферической крови. Установлена схема введения МП-1 мышам с циклофосфаниндуцированным иммунодецицитом, оптимальная для получения максимального иммунокорригирующего действия. Наиболее выраженный эффект МП-1 на количественные показатели и функциональную активность фагоцитов разной локализации показан при его введении до цитостатика; в этих условиях пептид влияет на нейтрофилы периферической крови. Полученные результаты позволяют рассматривать МП-1 как препарат, предохраняющий фагоциты периферической крови от повреждающего воздействия циклофосфана.
Ключевые слова: миелопептид-1 (МП-1), хемилюминесценция, фагоциты, функциональная актив -ность, иммуносупрессия, иммунокоррекция.
Б01: 10.7868/80132342313050072
ВВЕДЕНИЕ
Известно, что система фагоцитов является не только первым звеном противоинфекционной защиты, но и важнейшей составляющей развития специфического иммунного ответа. Коррекция нарушений системы фагоцитов особенно важна в случаях иммунодефицитов, индуцированных лекарственными препаратами, в том числе цитоста-тическими. В настоящее время ведется активный поиск препаратов, которые могли бы предохранять или нормализовать нарушения иммунитета, возникающие при лекарственной терапии [1, 2]. Одним из таких препаратов может считаться пептид костномозгового происхождения — миело-пептид-1 РИе-Ьеи-О^-РИе-Рго-ТЬг (МП-1), который был выделен, идентифицирован и синтезирован классическими методами пептидной химии в растворе [3]. Показано, что МП-1 нормализует антителообразование у животных с имму-
Сокращения: ККМ — клетки костного мозга; МП-1 — мие-лопептид-1; ФР — физиологический раствор ХЛ — хеми-люминисценция; ЦФ — циклофосфан, БОТА — этиленди-аминтетраацетат.РМА — форболмиристилацетат. #Автор для связи (тел.: +7 (495) 330-72-56, эл. почта: kiri1inae1en@yandex.ru).
нодефицитами различной этиологии, вызванных, в частности, радиацией, цитостатиками или антибиотиками [4—6]. Ранее было показано, что мишенью для данного регуляторного пептида являются СВ4+-Т-лимфоциты и в основе механизма иммунокорригирующего действия лежит его способность нормализовать нарушенный баланс СВ4/СЭ8-клеток (Т-хелперы/Т-супрессоры) [5, 7]. Однако участие МП-1 в процессах нормализации функциональной активности фагоцитирующих клеток при нарушениях, вызванных введением цитостатиков, до настоящего времени не изучено.
Целью данной работы было изучение способности МП-1 оказывать влияние на функциональную активность фагоцитов в условиях иммунодефицита, индуцированного цитостатиком — цик-лофосфаном (ЦФ).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В первой серии экспериментов определяли способность МП-1 влиять in vitro на функциональную активность фагоцитов крови и клеток костного мозга (ККМ) интактных мышей и мышей, обработанных циклофосфаном в дозе 3 мкг/мышь.
Таблица 1. Функциональная активность фагоцитов крови здоровых и обработанных циклофосфаном мышей после ее инкубации с МП 1 in vitro*
Здоровые мыши
Обработанные ЦФ мыши
Вид ХЛ* Контроль** МП 1 Индекс Контроль** МП 1 Индекс
М + м М + м изменений М + м М + м изменений
Спонтанная 138 + 9 196 + 11 1.42 691 + 64 600 + 53 0.87
Индуцированная зимозаном 261 + 36 520 + 72 1.99 946 + 69 679 + 78 0.72
Индуцированная FMA 451 + 36 681 + 49 1.51 1544+108 1125 + 132 0.73
* Функциональная активность клеток определялась методом хемилюминисценции (см. эксп.ч.) ** Контроль — инкубация in vitro клеток крови с ФР.
Таблица 2. Функциональная активность фагоцитов костного мозга здоровых и обработанных циклофосфаном мышей после инкубации ККМ с МП 1 in vitro
Здоровые мыши Обработанные ЦФ мыши
Вид ХЛ* Контроль** МП 1 in vitro Индекс Контроль** МП 1 Индекс
М + м М + м изменений М + м М + м изменений
Спонтанная 235 + 12 233 + 20 0.99 256 + 11 375 + 43 1.46
Индуцированная зимозаном 695 + 29 843 + 73 1.21 741 + 19 907 + 56 1.22
Индуцированная FMA 5061+605 7774 +912 1.54 2938 + 185 2962 +314 1.01
* Функциональная активность клеток определялась методом хемилюминесценции (см. эксп.ч.). ** Контроль — инкубация in vitro клеток крови с ФР.
Функциональную активность фагоцитов определяли по их способности к окислительному метаболизму и фагоцитозу методом хемилюминисцен-ции (ХЛ) (см. раздел "Экспериментальная часть"). К освобожденной от эритроцитов суспензии ККМ или лейкоцитов периферической крови добавляли МП-1 (10 мкл) в конечной концентрации 10 мкг/мл или 10 мкл физиологического раствора (ФР, контроль) и, после инкубации при 37°С в течение 1 ч, регистрировали спонтанную или индуцированную зимозаном или форболмиристил-ацетатом (БЫЛ) хемилюминисценцию. Результаты этих экспериментов представлены в табл. 1 и 2.
Показано, что после обработки циклофосфа-ном уровень спонтанной и индуцированной зи-мозаном или БЫЛ хемилюминисценции фагоцитов в 3—5 раз выше по сравнению с показателями функциональной активности нейтрофилов крови интактных животных. После инкубации клеток крови здоровых мышей с МП-1 (в концентрации 10 мкг/мл) уровень всех видов ХЛ повышался в 1.5—2 раза. Инкубация фагоцитов крови мышей,
обработанных цитостатиком с МП-1, приводила к частичной коррекции повышенной активности этих клеток, снижая показатели хемилюминесценции в среднем на 25%.
Таким образом, установлено, что под влиянием МП-1 происходит некоторая стимуляция функциональной активности клеток крови интактных животных и незначительная коррекция повышенных показателей функциональной активности фагоцитов крови мышей, обработанных ЦФ.
Несколько иная картина наблюдалась при оценке влияния МП-1 на хемилюминисценцию ККМ интактных или обработанных циклофосфа-ном мышей. Как видно из табл. 2, уровень спонтанной ХЛ фагоцитов костного мозга как здоровых, так и обработанных циклофосфаном мышей, был практически одинаков. Инкубация с МП-1 ККМ от обеих групп мышей не вызывала изменения уровня спонтанной ХЛ фагоцитов интактных животных и стимулировала почти в 1.5 раза этот показатель у иммунодефицитных мышей.
Лейкоциты Лимфоциты Фагоциты
Рис. 1. Показатели крови мышей, обработанных ЦФ (3 мг/мышь) с одновременным введением физиологического раствора (контроль) или МП-1 (10 мкг/мышь) По оси ординат показатели в процентах от показателей для интактных животных).
Введение мышам ЦФ не оказывало влияния также на реакцию фагоцитов костного мозга на зи-мозан. Инкубация этих клеток с МП-1 приводила к стимуляции уровня ХЛ как у нормальных, так и у иммунодефицитных мышей в среднем на 20%. Ответ фагоцитов костного мозга на FMA после введения ЦФ понижался почти в два раза, и инкубация таких фагоцитов с МП-1 не влияла на их активность, в то время как у ККМ интактных животных пептид увеличивал ответ на FMA в 1.5 раза.
Так, в экспериментах in vitro выявлено корригирующее влияние МП-1 на фагоциты крови и, в меньшей степени, на фагоциты костного мозга. По-видимому, МП-1 проявляет способность in vitro активировать резервные фагоциты крови и костного мозга как здоровых, так и иммунодефицитных мышей, но по каким-то причинам их фагоцитирующая активность остается заблокированной.
Полученные in vitro данные определили задачу дальнейшего исследования: оценить влияние МП-1 на количественные характеристики и функциональную активность фагоцитов здоровых или обработанных циклофосфаном мышей in vivo. Было использовано несколько схем введения МП-1 относительно цитостатика (см. раздел "Экспериментальная часть").
В первой модели изучено влияние МП-1 на фагоциты периферической крови и ККМ мышей, которым МП-1 вводили внутрибрюшинно (в/бр) в дозе 10 мкг/мышь через 2 сут после внутрибрю-шинного введения циклофосфана в дозе 3 мг/мышь. Оказалось, что при такой схеме введения МП-1 не только не влиял на функциональную активность фагоцитов, но и не изменял количественные показатели крови и костного мозга, сни-
1 2 3
Рис. 2. Функциональная активность фагоцитов крови интактных мышей, мышей, обработанных ЦФ и обработанных одновременно ЦФ и МП-1. Приведена спонтанная ХЛ (1) и ХЛ, индуцированная зимозаном (2) и БМА (3).
женные под влиянием цитостатика (данные не представлены). Это может объясняться тем, что развивающийся под влиянием циклофосфана иммунодефицит непродолжителен по времени и уже к 6-м суткам у мышей происходит восстановление показателей крови и костного мозга [8]. Включение собственных резервных механизмов в эти сроки исключает необходимость проведения дополнительной иммунокорригирующей терапии.
Во второй модели индуцированного цикло-фосфаном иммунодефицита МП-1 вводили мышам через 1.5—2 ч после цитостатика. На рис. 1 представлены количественные показатели клеток лейкоцитарного ряда: лейкоциты, лимфоциты и фагоциты мышей, обработанных циклофосфа-ном, а также животных, которым помимо циклофосфана вводили МП-1. Показано, что общее количество лейкоцитов, лимфоцитов и фагоцитов среди них в крови иммунодефицитных мышей составляют в среднем 35—60% от аналогичных значений для здоровых животных. Одновременное с цитостатиком введение МП-1 приводит к повышению указанных параметров на 25—35%.
Данные по влиянию МП-1 на функциональную активность фагоцитов крови при одновременном введении с циклофосфаном, представлены на рис. 2. Как видно из рисунка, функциональная активность фагоцитов крови под влиянием цито-статика повышена по
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.