ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2015, том 462, № 1, с. 111-114
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 577.29
ВЛИЯНИЕ МИКРОВЕЗИКУЛ КРОВИ НА КИНЕТИКУ ПОЛИМЕРИЗАЦИИ И ФЕРМЕНТАТИВНОГО ГИДРОЛИЗА ФИБРИНА
© 2015 г. Р. М. Набиуллина, И. Г. Мустафин, Ю. Ф. Зуев, Д. А. Файзуллин, Р. И. Литвинов, Л. Д. Зубаирова
Представлено академиком РАН В.А. Ткачуком 23.10.2014 г. Поступило 23.10.2014 г.
DOI: 10.7868/S0869565215130265
Несмотря на прогресс, достигнутый в диагностике и лечении гемостатических нарушений, тромбоз остается одной из основных причин заболеваемости и смертности в развитых странах [1]. Фибрин, составляющий структурную основу ге-мостатического сгустка или тромба, образуется из фибриногена под влиянием тромбина. Результатом полимеризации фибрина является формирование фибриновых волокон в виде разветвленной трехмерной сети, обеспечивающей механическую прочность сгустков и тромбов и их устойчивость к ферментативному гидролизу, называемому фибринолизом [2]. Архитектура фибриновой сети подвержена изменениям и зависит от рН, концентрации ионов кальция, фибриногена, ионной силы и т.д. Также важную роль играет активность тромбина: при низких концентрациях тромбина образуются неплотные фибриновые сгустки, состоящие из толстых волокон, в то время как при высоких концентрациях тромбина сгустки формируются из тонких, плотно упакованных волокон [3, 4]. Скорость образования активного тромбина, в свою очередь, зависит от различных факторов, в том числе от микровезикул (МВ), поступающих в кровь при активации и/или апоптозе клеток крови и эндотелия. МВ представляют собой частицы размером 0.1— 1 мкм. Механизм их образования, заключающийся в "отшнуровке" от наружной клеточной мембраны, обеспечивает им прокоагулянтные свойства, благодаря присутствию в их составе анионных фосфоли-пидов (обеспечивают сборку "теназного" и про-тромбиназного ферментных комплексов) и тканевого фактора (наиболее мощного активатора
Казанский государственный медицинский университет E-mail: zubairovalaily@gmail.com Казанский институт биохимии и биофизики Казанского научного центра Российской Академии наук
Казанский (Приволжский) федеральный университет
свертывания крови) [5]. Подавляющее число современных исследований МВ посвящено оценке их количества и антигенного фенотипа как потенциального маркера тромбофилии [6]. В то же время физиологическая и патогенетическая роль МВ полностью не расшифрована. В частности, нет систематизированных исследований влияния циркулирующих в крови МВ на формирование и свойства фибринового сгустка.
Целью настоящей работы явилось изучение кинетики фибринообразования и фибринолиза in vitro под влиянием МВ, образующихся естественным образом в крови здоровых людей.
Получение свободной от тромбоцитов плазмы крови (СТП), обедненной МВ плазмы (ОМП) и обедненной МВ плазмы с добавлением кефалина (ОМП-К). Кровь 15 здоровых доноров забирали из локтевой вены утром натощак, стабилизировали 3.8%-м цитратом натрия в соотношении 9 : 1 по объему и центрифугировали дважды при 1500g 15 мин и далее в режиме 10000g 5 мин для осаждения тромбоцитов и получения СТП. Для удаления МВ и получения ОМП СТП пропускали через фильтр с размером пор 0.1 мкм ("EMD Milli-pore", США). Для компенсации фильтрационных эффектов и восстановления уровня фосфолипи-дов к ОМП добавляли взвесь кефалина ("Технология-Стандарт", Россия) в конечной концентрации 300 мкг/мл и таким образом получали ОМП-К. В каждом опыте использовали родственные образцы свежеполученной плазмы, СТП, ОМП и ОМП-К от одного донора.
Подсчет МВ в образцах плазмы крови. СТП и ОМП исследовали методом проточной цитомет-рии на приборе FACS Calibur ("Becton Dickinson", США), как описано ранее [7] с модификациями. СТП и ОМП разводили 10-кратно фосфатным буфером, pH 7.4. Абсолютное количество МВ в 1 мкл определяли по светорассеянию за фиксированное время (60 с) с использованием программы CellQuest (США), регистрируя количество событий за единицу времени с учетом ско-
112
НАБИУЛЛИНА и др.
рости потока. Регистрация прямого малоуглового (FSC) и бокового (SSC) светорассеяния в логарифмических шкалах позволяет локализовать сигналы МВ в определенной зоне. Для калибровки прибора и ограничения области подсчета МВ использовали стандартные синтетические сферические частицы с диаметром 1, 2, 3, 5, 6 и 10 мкм (BD Pharmingen, "Becton, Dickinson and Company", США), рис. 1.
Определение кинетики полимеризации фибрина методом динамической турбидиметрии. В кювете спектрофотометра Perkin-Elmer Lambda 25, Molecular Devices ("Perkin-Elmer", США) смешивали 400 мкл плазмы (СТП, ОМП или ОМП-К) и 20 мкл 0.5 M хлорида кальция до конечной концентрации 0.024 М. Свертывание начинали регистрировать сразу после рекальцификации плазмы (нулевой момент времени). Формирование сгустка определяли по увеличению оптической плотности образца вследствие образования нерастворимых фибриновых волокон из растворимого фибриногена. Регистрацию проводили при длине волны 350 нм в кювете с толщиной оптического слоя 10 мм при 37°C в течение 2 ч (рис. 2). При анализе турбидиметрической кривой определяли следующие параметры: лаг-период (Lag), соответствующий времени генерации тромбина и образования протофибрилл; скорость полимеризации (V) — повышение оптической плотности на отрезке ее нарастания в единицу времени, которая характеризует скорость латеральной агрегации и формирования волокон фибрина; максимальная оптическая плотность при данной длине
волны (Атах), определяемая количеством поли-меризованного белка и толщиной фибриновых волокон.
Определение кинетики фибринолиза методом динамической турбидиметрии. К 400 мкл исследуемого образца плазмы (СТП или ОМП) одновременно с 20 мкл 0.5 М хлорида кальция добавляли 4 мкл тканевого активатора плазминогена (Т-АП) ("НУРНЕ^ВюМеё", Франция) в конечной концентрации 50 нг/мл. Т-АП вызывал превращение неактивного плазминогена в активный плазмин на волокнах фибрина в процессе и после их формирования, стимулируя их ферментативный плазмино-вый гидролиз. Турбидиметрическое исследование динамики фибринолиза проводили в течение 14 ч (рис. 3). Определяли следующие параметры турбидиметрической кривой: общее время лизиса (ТЬТ), т.е. время от добавления хлорида кальция и Т-АП до полного растворения сгустка; скорость лизиса фибрина (V) — снижение оптической плотности в единицу времени после достижения плато; время 50%-го лизиса (^/2) — время от добавления хлорида кальция и Т-АП до снижения оптической плотности до половины максимальной; время лизиса сгустка (СЬТ) — время между моментом возрастания оптической плотности до половины максимальной (фаза формирования сгустка) и моментом снижения оптической плотности до половины максимальной (фаза лизиса сгустка).
Обработку и графическое представление результатов турбидиметрии проводили с использо-
SSC 105
104
103
102
Л—10 мкм 6мкм -5 мкм -3 мкм -2 мкм
1 мкм
105 FSC
Рис. 1. Проточная цитометрия микровезикул. Представлена стратегия выделения зоны для подсчета микровезикул с помощью стандартных синтетических сферических частиц с диаметром 1, 2, 3, 5, 6 и 10 мкм. В области R1 производили подсчет общего количества микровезикул по их спонтанному светорассеянию с учетом скорости потока и разведения плазмы. R2 — исключаемая из подсчетов область "шума" буфера.
A (350 нм) 3
0U 0
Lag
60
Время, мин
Рис. 2. Регистрация кинетики полимеризации фибрина методом динамической турбидиметрии. Определяемые параметры: лаг-период (Lag) — время до начала нарастания плотности; повышение оптической плотности на отрезке ее нарастания в единицу времени (V) ; максимальная оптическая плотность при данной длине волны (Amax).
2
1
ВЛИЯНИЕ МИКРОВЕЗИКУЛ КРОВИ
113
Таблица 1. Влияние микровезикул на кинетику фиб-ринообразования
Параметры СТП ОМП ОМП-К
Lag (мин) 7.8 ± 3.4 29 ± 12 p < 0.01 4.0 ± 0.9
V (единицы ОП/c) ■ 10-3 108.2 ± 2.4 76 ± 14 p < 0.05 134 ± 12
Amax (единицы ОП) 2.5 ± 0.2 2.8 ± 0.1 p < 0.05 2.6 ± 0.1
Примечание. М± т, п = 7; здесь и в табл. 2 ОП — оптическая плотность; р — достоверность различий показателей ОМП по сравнению с таковыми СТП и ОМП-К.
ванием программы OriginLab 8 ("OriginLab", США), статистический анализ результатов — с использованием пакетов программ Excel и BioStat.
Анализ данных сравнительной проточной цито-метрии парных образцов СТП и ОМП (n = 12) выявил высокую эффективность фильтрации. Количество МВ в СТП составило 6.8 ± 1.3 • 107/мл, в ОМП - 0.9 ± 0.4 • 107/мл (p < 0.0001), т.е. при выбранном режиме фильтрации мы достигли удаления ~90% МВ. Чтобы исключить возможность потери фибриногена и его производных при фильтрации в СТП и ОМП определяли концентрацию коагулируемого фибриногена. Показатели его уровня до и после фильтрации достоверно не различались и составили соответственно 3.5 ± 1.0 и 3.0 ± 0.7 г/л (p > 0.05; n = 6).
Влияние МВ на кинетику образования фибрина.
Динамика турбидиметрии СТП и ОМП существенно различалась. Удаление микровезикул из ОМП сопровождалось многократным удлинением лаг-периода, достоверным снижением скорости полимеризации и повышением максимальной оптической плотности сгустка (табл. 1). При искусственном обогащении ОМП фосфолипида-ми мы наблюдали укорочение лаг-периода, повышение скорости полимеризации и снижение максимальной оптической плотности до уровней, соответствующих параметрам СТП (табл. 1), что свидетельствует о существенном влиянии МВ крови на кинетику образования и оптические свойства фибрина.
Влияние МВ на кинетику фибринолиза. Из табл. 2 следует, что удаление МВ из плазмы (ОМП) сопровождается уменьшением всех параметров, характеризующих время лизиса сгустка (TLT, t^2 и CLT), т.е. ускорением фибринолиза. Скорость лизиса фибрина (V) в ОМП была также достоверно выше, чем в СТП.
Таблица 2. Влияние микровезикул на кинетику фиб-ринолиза
Параметры СТП ОМП
TLT (мин) 809 ± 36 650 ± 51
p < 0.01
V (единицы ОП/мин) ■ 10-4 78 ± 11 104 ± 8
p < 0.01
t1/2 (мин) 639 ± 44 497 ± 44
p < 0.01
CLT (мин) 625 ± 55 453 ± 51
p < 0.01
Примечание. М± т, п = 5; р — достоверность различий показателей ОМП по сравнению с та
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.