ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 40, № 6, с. 630-633
УДК 575.224.22:616-056.7
ВЛИЯНИЕ МИОСТАТИНА И НЕКОТОРЫХ РОСТОВЫХ ФАКТОРОВ НА КУЛЬТИВИРУЕМЫЕ КЛЕТКИ ЧЕЛОВЕКА
© 2004 г. С. С. Шишкин*, Т. Б. Крохина**, В. С. Ахунов**, А. А. Макаров*, В. О. Попов*
*Институт биохимии им. АН. Баха РАН, Москва, 119071; e-mail: shishkin@inbi.ras.ru **Медико-генетический научный центр РАМН, Москва, 115478; e-mail: krokhina@yandex.ru Поступила в редакцию 29.04.2004 г.
С помощью специально разработанной клеточной биотест-системы показано, что миостатин и некоторые ростовые факторы человека оказывают специфические воздействия на пролиферацию культивируемых миобластов и фибробластов, причем миостатин ингибирует рост миобластов, не влияя на фибробласты человека. Гормон роста и инсулиноподобный фактор роста 1 в данной биотест-системе вели себя как антагонисты миостатина, что позволяет рассматривать их как потенциально возможные агенты для блокирования биологических эффектов миостатина in vivo.
В исследованиях биохимических механизмов контроля за росто-весовыми показателями у высших позвоночных, включая человека, значительное место уделяется белковым ростовым факторам (БРФ), от функционирования которых во многом зависят способности организма выполнять физическую работу и осуществлять ряд важных физиологических функций [1-3]. Установлено, что генетические дефекты или иные нарушения в системах БРФ могут приводить к серьезной патологии у людей и к их социальной дезадаптации, при этом заместительная терапия соответствующими белковыми препаратами часто обеспечивает долговременный положительный эффект [1, 4].
В последние годы внимание многих исследователей привлекает недавно открытый БРФ - миостатин, который относят к 0-семейству трансформирующих ростовых факторов, объединяющему несколько десятков близких по строению БРФ [5, 2, 3]. Показано, что миостатин обладает рядом необычных свойств, ингибирует развитие мышечных тканей у высших позвоночных, но при этом блокирование пути от гена к его продукту и далее к мышечным клеткам-мишеням сопровождается выраженными позитивными эффектами на метаболизм клеток скелетной мускулатуры. Продолжаются исследования миостатина и белков, обеспечивающих его биологическое действие, а также различных антагонистов. Сделаны определенные шаги к использованию результатов этих работ в космической биологии [6] и спортивной медицине [7]. Таким образом, разработки биохимических методов целенаправленного воздействия на регуляторную миостатиновую систему можно рассматривать как весьма перспективное направление в современной биохимии.
Среди существующих подходов к изучению биологических эффектов БРФ принципиально важное место занимает использование различных клеточных моделей на основе культивируемых клеток человека или других высших позвоночных [8, 9, 3]. Подобные модельные эксперименты (в отличие от работ на лабораторных животных) позволяют сравнительно быстро и без больших материальных затрат получить важную информацию об особенностях действия тех или иных БРФ, а также при использовании клеток человека преодолеть проблему видовой специфичности действия некоторых БРФ [1, 2, 9].
Цель работы - изучение влияния миостатина и некоторых других БрФ на клеточную пролиферацию в специально разработанной модельной системе из культивируемых миобластов и фибробластов, которые представляют собой клетки основных тканей (мышечной и соединительной соответственно) опорно-двигательного аппарата человека.
МЕТОДИКА
В работе использовали рекомбинантные препараты следующих БФР: миостатин человека ("US Biologica", США), гормон роста человека (Россия); а также инсулиноподобный фактор роста 1 человека, фактор роста фибробластов 2 человека, эпидермальный фактор роста человека и фактор роста гепатоцитов ("Preprotech", Израиль-Эстония); кроме того, в отдельных экспериментах анализировали фактор роста фибробластов 2 быка ("Serva", Германия) и инсулин свиной ("Fluka", Германия).
Для определения влияния БРФ на клеточную пролиферацию были использованы 4 нормальных клеточных штамма человека (2 культуры
миобластов и 2 культуры постнатальных фиброб-ластов), которые выводили самостоятельно и выращивали, как описано ранее [10, 9]. Для окрашивания клеток применяли кристаллический фиолетовый и тиазолил голубой (МТТ) производства "Merck" (Германия), а также краситель Гимза, флюоресцеин диацетат и йодистый пропидий и некоторые другие реагенты отечественного производства марки х.ч. или о.с.ч.
Исходя из целей и особенностей тестирования, клетки выращивали или непосредственно в 96-лу-ночных планшетах, или предварительно в стеклянных флаконах Карреля и пластиковых одноразовых матрасах фирм "Corning-Costar" (Нидерланды) или "Nunc" (Дания), или отечественного производства. Определение биологических эффектов ростовых факторов проводили после 72-часового воздействия (в основном на миобластных культурах) или недельного воздействия (в основном на фиб-робластных культурах) по связыванию кристаллического фиолетового или МТТ, как описано ранее [9, 11], а также по окрашиванию проб по методу Гимза [9] и по результатам определения растворимого и суммарного белка клеток по методу Лоури.
Измерение оптической плотности в пробах (лунках), содержащих окрашенные клетки, проводили на спектрофотометре "ЭФОС 9305" (Россия) при 594 нм (кристаллический фиолетовый), при 492 нм (МТТ) при 620 нм (метод Гимза) и при 750 нм (метод Лоури). Для построения калибровочных кривых зависимости интенсивности окрашивания клеток в лунках от количества посеянных клеток в этих лунках результаты измерений обрабатывали стандартными статистическими методами с применением компьютерных программ Sigma-Plot или Excel. Итоговые данные в виде M ± m (при n от 3 до 6), полученные для клеточных проб, которые культивировали в присутствии БРФ при различных концентрациях, пересчитывали в процентах по отношению к контролю и использовали при построении кривых "доза-эффект".
Параллельно для оценки морфологического состояния растущих клеток пробы микроскопи-ровали с использованием МБИ-3 ("ЛОМО", Россия), адаптированного как инвертированный микроскоп с помощью специальной насадки, как описано ранее [11].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
При разработке специализированной модельной системы, которая предназначалась для тестирования биологических эффектов БРФ, способных влиять на состояние опорно-двигательного аппарата человека, были выбраны культуры миобластов и фибробластов человека с учетом того,
(а)
0.4 - ■
уГ Я
0.30.2- ГУ 0.1/_I_I_I_I_I_I_I_I_
0 2 4 6 8 10 12 14 16
103 кл./лунку
Рис. 1. Характеристика клеточной биотест-системы. а - культура миобластов человека, окрашивание кристаллическим фиолетовым; б - зависимость оптической плотности от количества посеянных в лунки клеток. Окраска клеток красителем Гимза.
что эти клетки могут отражать состояние мышечной и соединительной ткани соответственно. Для каждого из выбранных тест-объектов и методов тестирования предварительно были установлены основные параметры, характеризующие данную систему, и построены калибровочные кривые, отражающие зависимость между количеством клеток, находящихся в пробе, и интенсивностью окрашивания их используемыми красителями, подобно тому, как это делалось ранее при исследованиях цитотоксического действия антибиотиков на клеточные культуры человека [12]. В качестве примера, на рис. 1а представлена микрофотография, иллюстрирующая равномерность окрашивания миобластов кристаллическим фиолетовым после культивирования их на 96-лу-ночных планшетах, а на рис. 16 - результаты построения калибровочной кривой для красителя Гимза. Как итог, выявленные прямо пропорциональные зависимости между интенсивностью окраски и количеством клеток в пробе позволили
632
ШИШКИН и др.
%
Рис. 2. Ростингибирующий эффект препарата реком-бинантного миостатина на культуры миобластов человека. Окраска: 1 - кристаллический фиолетовый, 2 - МТТ; 3 - по методу Гимза.
îШЩПкч
sV V. ч ^ V ■
L Ч* v> С * Л . tv
Рис. 3. Миотубы, образовавшиеся в результате диф-ференцировки миобластов человека, культивированных в присутствии миостатина.
проводить экспресс-тестирование биологических эффектов БРФ в модельной системе.
Изучение влияния миостатина и некоторых других БРФ на клеточную пролиферацию проводилось на основе параллельного определения их влияния на рост миобластов и фибробластов с построением кривых "доза-эффект" при использовании 3-4 видов тестирования, указанных выше. Кривые, отражающие влияние миостатина на рост миобластов человека (после вычитания показателей контрольных проб) приведены на рис. 2.
Как видно из представленных данных, миостатин ингибирует рост миобластов при концентрациях 0.75-3.0 мкг/мл, что коррелирует с результатами других авторов [8, 13]. При сравнении кривых на рис. 2 видно, что наиболее чувствительным показателем, свидетельствующим об ингибирующем влиянии миостатина, оказался тест на связывание МТТ. По существующим данным [14] этот краситель взаимодействует с дышащими митохондриями, поэтому можно предположить, что угнетение процессов энергообеспечения является одним из ранних и существенных проявлений ингибирую-щего действия миостатина.
Важно отметить, что миостатин, ингибируя рост миобластов, не вызывал появления в культу-
рах заметного количества нежизнеспособных или явно поврежденных клеток, т.е. не оказывал ци-тотоксического действия при данных дозах. Это было обнаружено с помощью двойного окрашивания культур флюоресцеин диацетатом (живые клетки) и иодистым пропидием (погибшие клетки). Более того, миобласты, культивированные в присутствии ингибирующих концентраций миостатина, сохраняли способность к дифференцировке с образованием многоядерных миотуб (рис. 3). В аналогичных экспериментах на фибробластных культурах не было зарегистрировано какого-либо определенного эффекта миостатина даже в более широком диапазоне доз (от 0.25 мкг/мл до 10 мкг/мл).
В целом результаты, полученные из анализа кривых "доза-эффект" как для МСТН, так и для некоторых других ростовых факторов, суммированы в таблице. Обращает внимание, что на куль
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.