ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ, Серия А, 2010, том 52, № 9, с. 1578-1584
РАСТВОРЫ
УДК 541(14+64)
ВЛИЯНИЕ МОДИФИКАЦИИ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫМИ ГРУППАМИ НА ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ПОЛИАЛКИЛЕНОКСИДОВ1
© 2010 г. Е. В. Нам, А. Е. Жирнов, Е. А. Литманович, Н. С. Мелик-Нубаров, И. Д. Гроздова
Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова Химический факультет 119991 Москва, Ленинские горы Поступила в редакцию 30.11.2009 г. Принята в печать 15.03.2010 г.
Ковалентная модификация полиалкиленоксидов — блок-сополимеров этиленоксида и пропиленок-сида с М ~ 2000 флуоресцеинизотиоцианатом или 7-нитробенз-2-оксадиазолом в соотношении 0.6—1 моль метки/моль полимера приводит к изменению физического состояния полимеров, уменьшению их растворимости в воде, коэффициента распределения в системе гексан—вода, критической концентрации агрегации и размера образующихся частиц.
Блок-сополимеры этиленоксида (ЭО) и про-пиленоксида (ПО) обладают амфифильными свойствами: гидрофильный блок ПЭО обеспечивает растворимость в воде, а гидрофобный блок ППО — взаимодействие с липидными мембранами [1]. Благодаря этому такие полимеры могут взаимодействовать с клетками и оказывать влияние на их свойства. Так, раковые клетки, устойчивые к широкому кругу лекарств, гибнут под действием противоопухолевого антибиотика, если к нему добавлен трехблочный блок-сополимер ПЭО-ППО-ПЭО-плюроник Ь61 [2]. Аналогичный эффект наблюдали и для двублочных сополимеров, в то же время были обнаружены и некоторые различия в характере действия этих сополимеров на модельные липидные системы, связанные, как предполагается, с их блочной архитектурой [3].
При изучении взаимодействия полимера с клетками зачастую прибегают к его ковалентной модификации флуоресцентными метками. Однако введение меток может приводить к изменению свойств модифицируемого вещества. Так, в результате присоединения 2-ацетоксибензоата к ПЭГ изменялась способность последнего образовывать комплекс с ПАК [4]. Введение флуоресце-инизотиоцианата ^ТС) даже в крупный белок с М = 66 х 103 изменяет общий заряд белка, его размер и изоэлектрическую точку [5]. Нельзя было исключить, что ковалентное присоединение флу-
1 Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (код проекта 0903-00445).
E-mail: grozdova@genebee.msu.ru (Гроздова Ирина Дмитриевна).
оресцентных меток к блок-сополимерам ЭО и ПО, которые на порядок меньше (М ~2000), также может приводить к изменению свойств полимеров. В литературе данные об этом отсутствуют.
Цель настоящей работы — выяснить, изменяются ли свойства блок-сополимеров ЭО и ПО при введении в их молекулу флуоресцентной метки. Исследование было проведено на двух сополимерах: трехбл очном плюронике L61 НО— ЭО2ПО30ЭО2-Н (Mw = 1890, Mw/Mn = 1.14) и дву-блочном REP (СН3)3СО-ЭО24ПО19 (Mw = 2190, Mw/Mn = 1.05). Плюроник L61 содержит две реакционно-способных группы ОН на концах гидрофильных блоков ПЭО, а двублочный сополимер REP имеет одну свободную группу ОН на конце гидрофобного блока ППО. Благодаря протяженному ПЭО-блоку REP гораздо более гидрофилен, чем плюроник L61.
В качестве флуоресцентных меток были взяты небольшой по размеру гидрофобный 4-хлор-7-нитробенз-2-окса-1,3-диазол (NBD-Cl) с М = 200 и FITC с М = 389, который ранее использовался для модификации плюроников [6]. В отличие от NBD FITC содержит карбоксильную группу и отрицательно заряжен при нейтральных значениях рН. Эти соединения широко применяются на практике, потому что они характеризуются высокими коэффициентами мольного поглощения в видимой области спектра и высокими квантовыми выходами флуоресценции, а также дают слабую фоновую флуоресценцию биологических образцов [7].
O.
N+
N
O
N
OH
HO
Cl
S=C=N
NBD-Cl FITC (S=C=N-флуоресцеин)
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В работе были использованы следующие реактивы: плюроник L61 ("Serva", Германия), NBD-Cl ("Sigma", США), ^№-карбонилдиимидазол ("Acros", Бельгия), 2,4,6-тринитробензолсульфо-кислота (ТНБС) ("Merck", Германия) и трис-("Реахим", Россия), дважды перекристаллизованный из воды. Полимер REP был предоставлен нам И.Н. Топчиевой, FITC (изомер I) — М.Б. Гот-тих. Бензол и диоксан были обезвожены кипячением с металлическим натрием в течение 8 ч. Остальные реактивы ("Реахим", Россия) не подвергали дополнительной очистке. Молекулярно-массовые характеристики исходных полимеров REP и L61 были определены методом ГПХ в ТГФ при 35°С на жидкостном хроматографе "Waters" с рефрактометрическим детектором и колонками, заполненными ультрастирагелем с размером пор 103 и 105 , и линейной колонкой. В качестве стандартов использовали узкодисперсные образцы полиэтиленгликолей фирмы "Waters" с M = 270— 6000. Хроматограммы обрабатывали на интеграторе "Data Module-730". Среднюю ММ конъюга-тов рассчитывали как сумму масс полимера и флуоресцентной метки с учетом среднего мольного соотношения метка—полимер и выделяющейся соляной кислоты в реакции с NBD-Cl.
Получение конъюгатов полимеров с флуоресцентной меткой
Взяли 0.5 г полимера и осушали его трехкратной азеотропной отгонкой с бензолом, затем инкубировали в 2 мл диоксана с восьмикратным мольным избытком ^№-карбонилдиимидазола по отношению к количеству ОН-групп в течение 12 ч в темноте при 45°С. Высокомолекулярный продукт реакции выделяли методом ГПХ на колонке Сефадекса LH-20 (2 х 70 см), уравновешенного этанолом, при скорости элюции 8 мл/ч и объеме фракции 4 мл. Появление модифицированного полимера в элюате регистрировали с помощью проточного фотометра по поглощению в УФ-области. Эти фракции упаривали на роторном испарителе без подогрева, растворяли в 2 мл этилендиамина и инкубировали 2 суток в темноте при 20°С. Избыток этилендиамина удаляли на
роторном испарителе, а сухой остаток растворяли в 2 мл этанола и фракционировали методом ГПХ в описанных выше условиях. Содержание амино-производных полимеров L61-NH2 и REP-NH2 во фракциях элюата определяли по реакции с ТНБС.
Для присоединения флуоресцентной метки к 100 мкл 0.1 М L61-NH2 или REP-NH2 добавляли 100 мкл 0.2 М бората (pH 9.5), либо 10-кратный мольный избыток FITC в 100 мкл диметилсуль-фоксида, либо 16-кратный мольный избыток NBD-Cl в 300 мкл диоксана и инкубировали в темноте при 20°С в течение суток. Продукты реакции разделяли методом ГПХ на колонке Сефадекса LH-20 (1 х 30 см), уравновешенного этанолом, при скорости элюции 6 мл/ч и объеме фракции 1 мл. Фракции анализировали методом спектрофотометрии при длине волны а = 465 и 494 нм при получении NBD- и FITC-производ-ных соответственно. Фракции элюата, содержащие конъюгат, объединяли, высушивали и растворяли в воде или в 10 мМ фосфатном буфере (рН 7.3), содержащем 145 мМ NaCl (буфер PBS), и хранили в замороженном состоянии. Выход конъюгатов составлял 78—90% в расчете на исходное аминопроизводное.
Количество аминогрупп определяли по реакции с ТНБС [8] с некоторыми модификациями. В лунки 96-луночного планшета вносили 2—3 мкл образца, 100 мкл буферного раствора 0.1 М бората натрия (рН 8.7) и 20 мкл свежеприготовленного раствора ТНБС (3 мг/мл) в воде. Интенсивность окраски измеряли при 405 нм на многоканальном спектрофотометре Multiscan Plus ("Titertek", США).
Концентрацию полимеров в водном растворе оценивали по содержанию групп ЭО, которые определяли по реакции с хлоридом бария и йодом в растворе йодида калия [9].
Количество групп NBD определяли по их поглощению в метаноле при 465 нм, s = 22000 см-1 М-1, содержание FITC — в водном буферном растворе (рН 8.0) при 494 нм, s = 68000 см-1 М-1 [10].
Коэффициент распределения полимеров в системе гексан-вода находили как описано в работе [11].
Гидродинамический радиус полимерных ассо-циатов и критическую концентрацию агрегации определяли методами статического и динамического светорассеяния при помощи фотометра рассеянного лазерного света "Photocor Complex" ("Photocor Instruments", США) с лазером He-Ne мощностью 10 мВт, X = 633 нм в качестве источника света. Перед измерениями готовили серию растворов полимеров разной конценрации в PBS. Непосредственно перед измерением образец обеспыливали при температуре 5°С фильтрованием через нитроцеллюлозные фильтры с диа-
D465> D317
3
2 и
0.4
0
10
14
18 V, мл
при помощи программы DynaLS по уравнению [12]
g2 (т) = 1 + a
J Z (D)exp (-q2Dx)dD
где а — численный параметр, z(D) — функция распределения рассеивающих частиц по коэффици-
ентам диффузии, q =
Ann
X 0
Рис. 1. Разделение Ь61-КБВ и свободного КБВ-С1 на колонке Сефадекса ЬН-20. По оси ординат указана оптическая плотность элюата Б = 465 (пик 1) и 317 нм (кривая 2).
метром пор 0.45 мкм. В фильтратах измеряли концентрацию полимеров и интенсивность их светорассеяния под углом 90°. Показания снимали через 3—5 мин после помещения холодного фильтрата в кювету, термостатируемую при 37°С. Каждый образец анализировали трижды.
Кросскорреляционные функции флуктуаций интенсивности рассеянного света g2(x) при исследовании динамического светорассеяния измеряли с помощью 288-канального коррелятора "Pho-tocor-FC" ("Photocor Instruments", США). Математическую обработку результатов проводили
sin--волновой вектор,
2
т — время удерживания сигнала. Программа решает уравнение методом регуляризации (результатом является распределение z(D)) или находит параметры определенным образом выбранного распределения методом кумулянтов. Гидродинамические радиусы рассеивающих частиц рассчитывали из коэффициентов диффузии по формуле
kT
Эйнштейна—Стокса Rh = •
впцЛ
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Модификация полимеров флуоресцентными метками
В связи с тем, что полимеры содержат концевую гидроксильную группу, а FITC и NBD эффективнее взаимодействуют с аминогруппами, в молекулу полимера вводили 2-аминоэтилкарбамат-ную группу путем инкубации сначала с карбонилдиимидазолом, а затем с этилендиами-ном:
2
6
N^ Т WN
L61—OH -0-- L61—-^ L61-0-C-NH NH2
0 C ^
L61-NH2
Полученные аминопроизводные полимеров модифицировали флуоресцентными метками: P-NH2 + NBD-Cl — P-NH-NBD + HCl, P-NH2 + + S=C=N-флуоресцеин — P-NH-CS-NH-флу-оресцеин, где Р — плюроник L61 или REP.
Таким образом бы
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.